Proximales Kultursystem: Eine In-vitro-Kulturtechnik zur Untersuchung der parakrinen Signalübertragung zwischen Zellen

Zusammenfassung

Quelle: Dasari, S. et al. Eine proximale Kulturmethode zur Untersuchung der parakrinen Signalübertragung zwischen Zellen.J. Vis. Exp. (2018)

In diesem Video entwickeln wir ein proximales Co-Kulturmodell von Eierstockkrebszellen und primären menschlichen Mesothelzellen. Dieses physiologisch relevante Modell ermöglicht die Untersuchung des parakrinen Signalwegs, bei dem die lokalisierten Konzentrationen der sezernierten Faktoren aufrechterhalten werden, während ein direkter zellulärer Kontakt verhindert wird.

Protokoll

A. Zellvorbereitung

1. Isolierung und Kultivierung humaner primärer Mesothelzellen
   1. Isolierung humaner primärer mesothelialer Zellen (HPMCs) aus dem menschlichen Omentum und Züchtung in einem vollständigen Wachstumsmedium [Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) mit 10 % fötalem Rinderserum, 1 % Penicillin-Streptomycin, 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren und 1 % Vitaminen] bei 37 °C und 5 % CO₂,
      Anmerkung: Die HPMCs werden in der Regel auf 100 % Konfluenz gezüchtet (Abbildung 1A).
2. Wachstumsbedingungen von Eierstockkrebszellen
   1. Züchten Sie HeyA8-Eierstockkrebszellen in vollständigem Wachstumsmedium bei 37 °C und 5 % CO₂,
      Anmerkung: Verwenden Sie HeyA8-Zellen, die auf etwa 80 % Konfluenz gezüchtet wurden (Abbildung 1B).

B. Zellkultur

1. Aufbau der proximalen Kultur
   1. Verwenden Sie Transwell-Einsätze für 6-Well-Platten mit einer 10 μm dicken, mit Gewebekulturen behandelten Polycarbonatmembran mit 0,4 μm Poren (10⁸ Poren/cm²) und einer Wachstumsfläche von 4,67 cm². Optimieren Sie bei Bedarf für verschiedene Einsatzgrößen, indem Sie die Anzahl der ausgesäten Zellen entsprechend der Wachstumsoberfläche skalieren. Vor Gebrauch das gesamte Wachstumsmedium, Trypsin und phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf 37 °C erwärmen.
2. Vorbereiten der Beilagen
   1. Um die HeyA8-Zellen auf die Unterseite der Membran des Einsatzes zu säen, nehmen Sie den Einsatz mit einer sterilen Pinzette aus der Verpackung und legen Sie ihn umgedreht in eine sterile 15-cm-Kulturschale.
   2. Verwenden Sie eine 15-cm-Schale, da sie tief genug ist, um den umgedrehten Einsatz aufzunehmen, oder ersetzen Sie sie durch einen geeigneten sterilen Behälter. Je nach Versuch legen Sie die benötigte Anzahl an Einsätzen in die 15 cm Schale.
   3. Beschriften Sie die drei Kontrollen und drei Versuchsbedingungen entsprechend mit einer Markierung am Rand der Einsätze.
3. Vorbereitung der Krebszellen
   1. Um die HeyA8-Zellen, die bei 80% Konfluenz in einem 25 cm² Kolben (~2 x 10⁶ Zellen) gezüchtet wurden, zu trypsinisieren, fügen Sie 1 ml Trypsin (0,25%) für 40–60 s hinzu und neutralisieren Sie das Trypsin mit 6 mL vollständigem Wachstumsmedium.
   2. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 x g bei Raumtemperatur (RT) für 3 Minuten, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 5 mL vollständigem Wachstumsmedium. Zählen Sie die lebenden Zellen mit der Methode zum Ausschluss von Trypanblau-Farbstoffen.
4. Aussaat der Krebszellen
   1. Suspendieren Sie 100.000 Zellen/ml lebende HeyA8-Zellen in vollständigem Wachstumsmedium. Säen Sie vorsichtig 80.000 HeyA8-Zellen aus, die in 800 μl vollständigem Wachstumsmedium suspendiert sind, auf der Unterseite des Einsatzes (der jetzt nach oben zeigt, da er umgedreht ist).
   2. Versäen Sie die Zellen, um eine kuppelartige Form zu bilden, so dass die Zellen auf dem Einsatz verbleiben (Abbildung 1C). Beginnen Sie in der Mitte der Membran und bewegen Sie sich in konzentrischen Kreisen nach außen, während Sie langsam pipettieren. Vermeiden Sie es, mehr als 3 mm vom Rand entfernt zu sein, um ein Verschütten des Mediums zu verhindern.
      Anmerkung: Die Anzahl der ausgesäten Zellen hängt von der Wachstumsrate der Zellen und der Dauer des Experiments ab. Die Anzahl der HeyA8-Zellen, die für diese proximale Kultur ausgesät wurden, wurde optimiert, und die Zellen werden am Ende des dritten Tages zu 80–90 % konfluent sein.
5. Anhaftung von Krebszellen
   1. Decken Sie die 15 cm lange Schale ab und schieben Sie die Schale mit den Einsätzen vorsichtig in den CO₂ -Inkubator. Es ist wichtig, den Tropfen des Mediums und der Zellen auf dem Einsatz bei diesem Schritt nicht zu stören. Lassen Sie die Zellen 4 h lang bei 37 °C, damit sich die Krebszellen an der Einlage festsetzen können.
6. Vorbereitung der Mesothelzellen
   1. Nach etwa 4 h trypsinisieren Sie die bei 100% Konfluenz gezüchteten HPMCs in einem 75 cm² Kolben (~4 x 10⁶ Zellen) mit 2 mL Trypsin (0,25%) für 1–2 min und neutralisieren das Trypsin mit 12 mL vollständigem Wachstumsmedium.
   2. Zentrifugieren Sie die Zellen 3 Minuten lang bei 500 x g bei RT, resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 ml vollständigem Wachstumsmedium und zählen Sie die lebenden Zellen mit der Trypanblau-Farbstoffausschlussmethode.
7. Aussaat der Mesothelzellen
   1. Suspendieren Sie 300.000 Zellen/ml lebende HPMCs in vollständigem Wachstumsmedium. Geben Sie 2,5 ml frisches, vollständiges Wachstumsmedium in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Bringen Sie die 15 cm lange Schale mit den Einsätzen vorsichtig zur Biosicherheitshaube. Drehen Sie den Einsatz mit einer sterilen Pinzette um und platzieren Sie ihn so in der Vertiefung der 6-Well-Platte, dass er aufrecht steht, wobei die HeyA8-Zellen an der Unterseite befestigt sind und in das vollständige Wachstumsmedium eingetaucht sind (Abbildung 1C).
   2. Säen Sie 450.000 HPMCs, die in 1,5 ml Wachstumsmedium suspendiert sind, in der Innenseite der Inserts, wobei die HeyA8-Zellen an der Oberfläche befestigt sind, die dem Boden der Vertiefung zugewandt ist (Abbildung 1C) oder an Inserts ohne HeyA8-Zellen für die HPMC-Kontrollen. Geben Sie 1,5 ml Wachstumsmedium ohne Zellen zu den HeyA8-Kontrollen.
8. Wachstum der proximalen Kultur
   1. Lassen Sie die proximale Kultur im CO₂ -Inkubator bei 37 °C und 5% CO₂ 72 h lang wachsen. Bei Bedarf kann das Medium wie folgt nachgefüllt werden.
      1. Für die Innenseite des Einsatzes 750 μl entfernen und 750 μl frisches volles Wachstumsmedium hinzufügen.
      2. Entfernen Sie für die Außenseite des Einsatzes (die 6-Well-Platte) 1 ml und fügen Sie 1 ml frisches, vollständiges Wachstumsmedium hinzu. Der 1 mL wurde gewählt, um das Medium in einem Schritt zu wechseln. Falls gewünscht, können stattdessen 1,25 mL entnommen und ausgetauscht werden.

Ergebnisse

Abbildung 1: Aufbau des proximalen Kultursystems.(A) Dieses Bild zeigt humane primäre Mesothelzellen (HPMCs). (B) Dieses Panel zeigt HeyA8-Eierstockkrebszellen. Maßstabsleisten = 200 μm (A-B). (C) HeyA8-Zellen wurden auf der Unterseite eines Transwell-Inserts mit 0,4 μm Poren ausgesät. Nachdem die Zellen befestigt waren, wurde der ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
24 mm durchlässige Transwell-Halterung mit 0,4 μm Poren-Polycarbonat-Membraneinlage	Corning (Costar)	3412	• 10 μm dicke transluzente Polycarbonat-Membran. • Behandelt für eine optimale Zelladhäsion. • Verpackt 6 Einsätze in einer 6-Well-Platte, 4 Platten pro Karton. • Die Membran muss für die Sichtbarkeit der Zellen gefärbt werden. • Sterilisiert durch Gammastrahlung.
6-Well-Platte	Corning (Falke)	353046	Flachboden, TC-behandelt, steril, mit Deckel
15 cm Kulturschale	Corning (Falke)	353025	Sterile, TC-behandelte Zellkulturschale
DMEM	Corning (Cellgro)	10-013-CV
Penicillin Streptomycin	Corning	30-002-CI
MEM Nicht-essentielle Aminosäuren	Corning (Cellgro)	25-025-CI
Pipets			Jede Marke ist in Ordnung
CO2-Inkubator			Jede Marke ist in Ordnung
Schrank der Biosicherheitsstufe II			Jede Marke ist in Ordnung

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