Modellierung der Metastasierung von Eierstockkrebs in der Peritonealhöhle: Eine Methode zur Erstellung eines In-vitro-3D-Modells der Peritonealschleimhaut

Zusammenfassung

Quelle: Peters, P. N. et al. Modellierung der frühen Schritte der Ausbreitung von Eierstockkrebs in einer organotypischen Kultur der menschlichen Bauchhöhle. J. Vis. Exp. (2015)

In diesem Video demonstrieren wir die Entwicklung eines in vitro dreidimensionalen Modells der Auskleidung der Bauchhöhle. Diese organotypische Kultur kann helfen, die Adhäsion, Invasion und Proliferation von Eierstockkrebszellen zu untersuchen.

Protokoll

>1. Plattierung der organotypischen Kultur

1. Freisetzen Sie NOF (normale omentale Fibroblasten) aus einem 75 cm^{2-Kulturkolben} frei, indem Sie mit 10 ml PBS, gefolgt von 3 ml 0,25 % Trypsin/25 mM EDTA, für nicht mehr als 5 Minuten spülen. Neutralisieren Sie Trypsin mit mindestens dem 3-fachen Volumen des vollen Wachstumsmediums.
2. Trypsinisierte Zellen in ein konisches 50-ml-Röhrchen geben und bei 0,5 g x 3 min nach unten schleudern. Überstand entfernen und die Zellen in 5 ml vollem Wachstumsmedium wieder nach oben bringen. Verwenden Sie einen Zellzähler, um die aus dem Kulturkolben gewonnenen Zellen zu zählen.
3. Verdünnen Sie die Zellen mit dem entsprechenden Volumen des Vollwachstumsmediums auf eine schwarze 96-Well-Platte mit 2.000 bis 4.000 NOF pro 100 μl mit klarem Boden. Geben Sie 0,5 μg/100 μl Rattenschwanzkollagen I vor dem Plattieren in die Zellmischung. Lassen Sie die Zellen bei 37 °C in 5 % CO₂ in einer befeuchteten Umgebung mindestens 4 h lang ruhen oder bis die Zellen an der Plattenoberfläche haften.
4. HPMC (primäre humane Mesothelzellen) werden unter Verwendung der gleichen Methoden aus dem Kulturkolben freigesetzt, die in den Schritten 1.1 und 1.2 beschrieben sind. Verdünnen Sie die Zellen in der entsprechenden Menge des vollen Wachstumsmediums, um 10.000-20.000 HPMC pro 50 μl auf das bereits mit Kollagen I beschichtete NOF in 96-Well-Platten aufzusetzen. Lassen Sie die Zellen mindestens 18 Stunden bei 37 °C in 5 % CO₂ in einer befeuchteten Umgebung ruhen, bevor Sie mit den Experimenten beginnen.
5. Kultivieren Sie grün fluoreszierendes Protein (GFP)-exprimierende HeyA8-Eierstockkrebszellen in vollen Wachstumsmedien. HeyA8-Eierstockkrebszellen werden fluoreszenzmarkiert durch Expression eines lentiviralen Vektors, der Copepod cGFP (pCDH-CMV-MCS-EF1) exprimiert. HeyA8-Eierstockkrebszellen sollten am Tag der Anwendung zu 80-90% konfluent sein (logarithmische Wachstumsphase). Geben Sie die Zellen von der Kulturplatte ab und zählen Sie sie mit den gleichen Methoden, die in den Schritten 1.1 bis 1.2 für Primärzellen beschrieben wurden.
6. Lassen Sie die Eierstockkrebszellen sich 15-20 Minuten lang bei 37 °C in einem konischen Röhrchen mit locker verschlossenem Deckel in vollem Wachstumsmedium erholen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Pbs	Fisher Scientific	SH3001304
15 cm Kulturschalen	BD Biowissenschaften	353025
DMEM mit L-Glutamin	Corning	10-013-CV
MEM-Vitamine	Corning	Artikel-Nr.: 25-020-CL
MEM Nicht-essentielle Aminosäuren	Corning	25-025-CI
Penicillin-Streptomycin	Corning	30-002-CI
Mixbecher	Thermo-Fischer	MaxQ 4450
Zentrifuge	Eppendorf	Nr. 5702
Brutkasten	Thermo-Fischer	Forma Serie II Wassermantel CO2-Inkubator Modell 3100
Trypsin EDTA, 1x (0,25%)	Corning	25-053-CI
T-75 Fläschchen	BD Biowissenschaften	353136
T-175 Fläschchen	BD Biowissenschaften	353112
Pipettenspitzen	Rainin	P2, P10, P20, P200 und P1000
Pipettenspitzen	Corning	Gefilterte Spitzen P2, P10, P20, P200 und P1000
Zell-Zähler	Invitrogen	Gräfin
Gräfin Zellzählkammer Diapositive	Invitrogen	Nr. C10313
Trypan-Blauer Fleck (0,4 %)	Gibco	Tel.: 15250-061
Kollagen Typ I (Rattenschwanz)	BD Biowissenschaften	354236
96 Well Platte, klarer Boden, schwarz	BD Biowissenschaften	353219