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Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.
>1. Isolierung und Kultur von primären, nicht transformierten Stromazellen
- Entnahme und Aufbereitung von menschlichem Gewebe.
- Entnehmen Sie Proben des menschlichen Omentums, 2 cm3, das während einer Bauchoperation entnommen wurde, und tauchen Sie das Gewebe sofort in RT-Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (Abbildung 1A). Ein Stück Omentum von 3 cm x 2 cm ergibt typischerweise 1 Million primäre humane Mesothelzellen (HPMC) und 200.000 primäre humane Fibroblasten oder normale omentale Fibroblasten (NOF).
- Schleudern Sie das PBS herunter und tauchen Sie das Gewebe so bald wie möglich nach der Entnahme 3 Minuten lang bei 0,5 x g ein (< 2 Stunden bei PBS) und überführen Sie das Gewebe in einem konischen 50-ml-Röhrchen in frisches 20 ml PBS. Schneiden Sie das Gewebe in 5 mm3 Stücke, indem Sie es mit Skalpellen in einer sterilen Kulturschale mit einem Durchmesser von 15 cm zerkleinern (Abbildung 1B).
- Primäre Isolierung humaner Mesothelzellen
- Um HPMC zu isolieren, geben Sie das zerkleinerte Gewebe in konische 50-ml-Röhrchen und warten Sie 1 Minute, bis die festen Stücke nach oben schwimmen (Abbildung 1C und D). HPMC und rote Blutkörperchen (RBC) sind in der Flüssigkeit am Boden vorhanden. Verwenden Sie eine Pipette, um die Flüssigkeit vom Boden des Röhrchens in ein neues konisches Röhrchen zu entfernen. Schleudern Sie die Flüssigkeit 3 min lang bei 0,5 x g herunter und saugen Sie den Überstand aus dem HPMC/RBC-Pellet an.
- Wiederholen Sie den Vorgang dreimal: Geben Sie 20 ml PBS in das gehackte Gewebe, lassen Sie das Gewebe aufsteigen, entfernen Sie die Flüssigkeit vom Boden mit einer Pipette und geben Sie sie in das HPMC/RBC-Röhrchen, schleudern Sie nach unten und entfernen Sie den Überstand. Nachdem alle Drehungen abgeschlossen sind und der Überstand aspiriert ist, enthält das Pellet HPMC und RBC.
- Alle Zellen aus dem Pellet werden in einen 75 cm2 Kolben mit 15 ml Vollwachstumsmedium (DMEM mit 10 % fötalem Rinderserum [FBS], 1 % MEM-Vitamine [93 mg/L], 1 % MEM-nichtessentielle Aminosäuren [81,4 mg/L], 1 % Penicillin-Streptomycin [Pen-Strep, 100 E/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin]) gegeben.
- Führen Sie eine sekundäre PBS-Wäsche durch, um weitere HPMCs zu isolieren.
- Für die sekundäre PBS-Wäsche schütteln Sie das restliche feste Gewebe bei 200 U/min, 37 °C für 10 min in 20 ml PBS und warten Sie dann 1 min, bis das Gewebe nach oben schwimmt. Die Flüssigkeit vom Boden des Röhrchens in ein neues Röhrchen entnehmen, 3 min lang bei 0,5 x g zentrifugieren und den Überstand ansaugen.
- Das gesamte HPMC/RBC aus der sekundären PBS-Wäsche wird in einen separaten 75 cm2-Kolben in 15 ml Vollwachstumsmedium gegeben.
- Um restliches HPMC zu isolieren, schütteln Sie das zerkleinerte Gewebe 10 Minuten lang bei 200 U/min bei 37 °C in 20 ml einer 1:1 0,25 %igen Trypsin-25-mM-EDTA:PBS-Lösung. Lassen Sie das Gewebe aufsteigen, sammeln Sie die Flüssigkeit am Boden des Röhrchens in ein neues 50 ml Röhrchen und schleudern Sie es 3 Minuten lang mit 0,5 x g nach unten.
- Der Überstand wird aspiriert und die gesamte HPMC/RBC in einem separaten 75 cm2-Kolben in 15 ml Vollwachstumsmedium plädiert.
- Kultivieren Sie die plattierten Zellen bei 37 °C und 5 % CO2 in einer befeuchteten Umgebung. Füttern Sie plattierte Zellen, indem Sie an den Tagen 3 und 5 15 ml volles Wachstumsmedium hinzufügen, ohne das verbrauchte Medium zu entfernen. HPMC kann 5-7 Tage lang kultiviert werden, bevor es gespalten wird.
- Verwenden Sie in allen Experimenten HPMC mit geringer Passage (bis Passage 2), um die Dedifferenzierung und Modifikation des ursprünglichen Phänotyps zu minimieren. Verwenden Sie ein Weitfeldmikroskop, vorzugsweise mit einem 20-fach-Objektiv mit plastischem differentiellen Interferenzkontrast oder einem 4-20-fach-Objektiv mit Phasenkontrast (Phasenkontrastfilter am Mikroskop), um alle Bilder von Zellen aufzunehmen, und ein 10-fach-Objektiv ()im Hellfeld, um immunhistochemische 3,3'-Diaminobenzidin (DAB)-Färbung zu analysieren.
- Bestätigen Sie, dass die HPMC quaderförmig sind und Cytokeratin 8 und Vimentin exprimieren, indem Sie Immunhistochemie durchführen (Abbildung 2A, C, E).
