Modellierung der Besiedlung von Ovarialkarzinomzellen mit Omentum: Eine ex vivo Methode zur Etablierung der Milchfleckenbesiedlung von fluoreszenzmarkierten Ovarialkarzinomzellen in murinen Omentum-Explantaten

Zusammenfassung

Quelle: Krishnan, V. et al. In-vivo- und Ex-vivo-Ansätze zur Untersuchung der metastasierenden Besiedlung von Milchfleckenstrukturen bei Eierstockkrebs. J. Vis. Exp. (2015)

In diesem Video etablieren wir eine ex vivo omentale Organkultur, die mit GFP-exprimierenden Eierstockkrebszellen überlagert ist, um die Besiedlung von Eierstockkrebs innerhalb der omentalen Explantation zu untersuchen. Dieses Protokoll analysiert Immunzellstrukturen innerhalb des Omentums, die als Milchflecken bekannt sind und Metastasen begünstigen.

Protokoll

Alle Verfahren, die Tiere betreffen, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Besiedlung durch Milchflecken ex vivo

1. Festlegung grundlegender Bedingungen für die Kultur von ex-vivo-mentalen Organen
   1. Setzen Sie jedes Omentum in einen einzelnen Kulturplatteneinsatz ein und platzieren Sie es in einer Vertiefung einer 12-Well-Gewebekulturplatte mit 500 μl DME/F12-Medien mit 20 % FCS. Halten Sie Organkulturen 24 bis 48 Stunden lang bei 37 °C in einer Umgebung mit 5 % CO₂ für 24 bis 48 Stunden und/oder zu weiteren Zeitpunkten. Verwenden Sie drei unabhängige Omenta (dreifache Proben) für jede Bedingung (z. B. Medientyp/Zeitpunkt).
   2. Um die Unversehrtheit des Gewebes an den experimentellen Endpunkten zu bestätigen, fixieren und verarbeiten Sie die Proben wie in Schritt 1.1.3 beschrieben. Die Zählung von gesunden und nekrotischen Adipozyten in H&E-Schnitten kann die Gewebeintegrität beurteilen. Mindestens ~120 Zellen aus fünf biologischen Proben sind erforderlich, um einen Prozentsatz des vorhandenen lebenden Gewebes zu formulieren.
   3. Zur Messung der Gewebefunktion werden die Omenta (n=3) in separate Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit 500 μl DME/F12-Medium mit 20 % FCS gelegt. Lassen Sie das Medium 24 Stunden lang bei 37 °C in einer Umgebung mit 5 % CO₂ konditionieren und entfernen Sie dann 250 μl zur Verwendung in einem IL-6-ELISA-Assay.
2. Ex vivo Co-Kultur des Maus-Omentums mit SKOV3ip.1-GFP-Zellen
   1. Züchten und bereiten fluoreszenzmarkierte Zellen vor, indem 1 x 10⁶ aufgetaute Zellen in 10 ml Medium in einen T-75-Kolben pipettiert werden. Lassen Sie die Zellen bei 37 °C in einer Umgebung von 5 % CO₂ wachsen, bis sie einen Konfluenz von 70 % erreichen. Trypsinisieren und resuspendieren in einer Konzentration von 2 x 10⁶ Zellen pro ml.
   2. Tragen Sie ~6 μl des Gewebeklebers auf die Membran des Kultureinsatzes auf und lassen Sie ihn an der Luft trocknen. Waschen Sie die Membran zweimal mit sterilem Wasser, um überschüssigen Klebstoff zu entfernen. Trocknen Sie die Membranen an der Luft unter einer laminaren Haube.
   3. Schneiden Sie die Omenta vorsichtig aus und befestigen Sie sie mit einer sterilen Pinzette an der mit Klebstoff beschichteten Membran. Lassen Sie das Gewebe 1 Minute lang an der Membran haften, bevor Sie das Medium hinzufügen. Geben Sie 500 μl der Zellsuspension auf jedes Omentum in jedem Kultureinsatz. Füllen Sie den Bereich um die Transwell-Kammer mit 2,5 ml DME/F-12 .
   4. Inkubieren Sie das Omenta mit Zellsuspension für 6 Stunden bei 37 °C in einer Umgebung mit 5 % CO₂. Entfernen Sie die Omenta vorsichtig und waschen Sie sie mit ~10 ml PBS. Visualisieren Sie fluoreszierende Krebszellherde mit einem geeigneten Fluoreszenzbildgebungssystem.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Sezierwerkzeuge	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Na
Geimsa	Fluka/Sigma Aldrich	Artikel-Nr.: 48900
5% Formalin	Sigma	HT501320
DMEM	Corning	10-013-CV
Pbs	Corning	21-040-CV	Ohne Calcium und Magnesium
Kollagenase	Worthington	LS004196
Einsatz der Millicell-Kulturplatte	Millipore	PICM01250
Zell-Tak	Corning	Artikel-Nr.: 354240