Gewinnung von primären Eierstockkrebszellen aus festen Proben: Eine Methode zur Kultivierung von epithelialen Eierstockkrebszellen aus Eierstocktumorproben

Zusammenfassung

Quelle: Pribyl, L. J. et al. Methode zur Gewinnung primärer Eierstockkrebszellen aus festen Proben. J. Vis. exp. (2014)

In diesem Video beschreiben wir eine Methode zur Isolierung und Charakterisierung von primären Eierstockkrebszellen aus soliden Eierstocktumorgewebeproben. Die mit diesem Protokoll gewonnenen Epithelkarzinomzellen eignen sich zum Verständnis der Prozesse, die zur Entstehung und Entwicklung von Eierstockkrebs führen können.

Protokoll

Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.

>1. Gewebeverarbeitung

1. Unter sterilen Bedingungen werden die Proben in eine Petrischale (60 mm x 60 mm) mit 10 ml frischem, eiskaltem PBS überführt und mit einer sterilen Rasierklinge weiter in möglichst kleine Stücke (2 mm oder weniger) geschnitten (Abbildungen 1A und 1B).
2. Das zerkleinerte Gewebe wird in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 10 ml vorgewärmter (37 °C für 30 min) Dispase II (2,4 U/ml) in DMEM überführt und 30 min lang bei 5 % CO₂ und 37 °C inkubiert. Um einen optimalen Aufschluss der Proben zu gewährleisten, rühren Sie die Zellaufschlämmung alle 5 Minuten manuell um.
3. Nach einer 30-minütigen Inkubation wird die Zellaufschlämmung (mit einer serologischen 10-ml-Pipette) auf ein Zellsieb (70 μm Netz) übertragen, das auf ein konisches 50-ml-Röhrchen gelegt wird, und mit einem Spritzenkolben einen sanften Druck auf das Netz ausgeübt. Entsorgen Sie jegliches undissoziierte Gewebe (das auf der Oberseite des Netzes verbleibt) und sammeln Sie die erhaltene Zellsuspension in dem sterilen konischen 50-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie bei 320 x g für 7 min bei 4 °C (Abbildung 2).
4. Der Überstand wird verworfen und das Zellpellet in 10 ml DMEM mit 10 % FBS resuspendiert.
5. Die Zellsuspension wird in einer Petrischale bei 5 % CO₂ und 37 °C inkubiert (Abbildung 3).
6. Wechseln Sie das Medium nach 24 Stunden nach der ersten Beschichtung. Dies ermöglicht die Entfernung von Zelltrümmern und der Mehrheit der in der Kultur vorhandenen Erythrozyten.
7. Wechseln Sie das Medium in den folgenden zwei Wochen alle drei Tage, danach sind die Kulturen des primären EOC bereit für nachgeschaltete Anwendungen.

Ergebnisse

Abbildung 1. Aufbereitung von klinischen Proben. A) Feste Probe, die auf eine Petrischale mit 10 ml frischem, eiskaltem 1x PBS übertragen wird. B) Klinische Proben, die weiter in etwa 2 mm große Stücke geschnitten

werden

Ab...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1x PBS, steril	Invitrogen	Nr. 14190-144
Schraubdeckel, Probe aus Polypropylen Behälter, steril	Thermo Scientific
DMEM-Medium, steril	Invitrogen	Nr. 11995-065
Fötales Rinderserum, steril	Thermo Scientific Hyclone	SH30396.03
100x Penicillin-Streptomycin, flüssig	Invitrogen	Nr. 15140-122
Dispase II, steril	Roche	Tel.: 04942 078 001
Kleine Pinzette und Skalpell mit feiner Spitze Klinge, steril	Fisher Scientific	Pinzette: 08-953E, Klingen: 08-927-5D
Kleine Präparierschere, steril	Fisher Scientific	Tel.: 08-945
15 ml Röhrchen mit konischem Deckel, steril	BD Falke	352097
50 ml Röhrchen mit konischem Deckel, steril	BD Falke	352027
10 ml Serologische Pipette, steril	Corning	13-678-11E
6 ml Spritzenkolben, steril	Tyco Gesundheitswesen	8881516911
Nylonfilter (70 μm) Zellsieb, keimfrei	BD Falke	Artikel-Nr.: 352350
5 cm Petrischale, steril	Corning	430166
10 cm Petrischale, steril	Corning	430167