Gewinnung von primären Eierstockkrebszellen aus festen Proben: Eine Methode zur Kultivierung von epithelialen Eierstockkrebszellen aus Eierstocktumorproben

Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.

>1. Gewebeverarbeitung

1. Unter sterilen Bedingungen werden die Proben in eine Petrischale (60 mm x 60 mm) mit 10 ml frischem, eiskaltem PBS überführt und mit einer sterilen Rasierklinge weiter in möglichst kleine Stücke (2 mm oder weniger) geschnitten (Abbildungen 1A und 1B).
2. Das zerkleinerte Gewebe wird in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 10 ml vorgewärmter (37 °C für 30 min) Dispase II (2,4 U/ml) in DMEM überführt und 30 min lang bei 5 % CO₂ und 37 °C inkubiert. Um einen optimalen Aufschluss der Proben zu gewährleisten, rühren Sie die Zellaufschlämmung alle 5 Minuten manuell um.
3. Nach einer 30-minütigen Inkubation wird die Zellaufschlämmung (mit einer serologischen 10-ml-Pipette) auf ein Zellsieb (70 μm Netz) übertragen, das auf ein konisches 50-ml-Röhrchen gelegt wird, und mit einem Spritzenkolben einen sanften Druck auf das Netz ausgeübt. Entsorgen Sie jegliches undissoziierte Gewebe (das auf der Oberseite des Netzes verbleibt) und sammeln Sie die erhaltene Zellsuspension in dem sterilen konischen 50-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie bei 320 x g für 7 min bei 4 °C (Abbildung 2).
4. Der Überstand wird verworfen und das Zellpellet in 10 ml DMEM mit 10 % FBS resuspendiert.
5. Die Zellsuspension wird in einer Petrischale bei 5 % CO₂ und 37 °C inkubiert (Abbildung 3).
6. Wechseln Sie das Medium nach 24 Stunden nach der ersten Beschichtung. Dies ermöglicht die Entfernung von Zelltrümmern und der Mehrheit der in der Kultur vorhandenen Erythrozyten.
7. Wechseln Sie das Medium in den folgenden zwei Wochen alle drei Tage, danach sind die Kulturen des primären EOC bereit für nachgeschaltete Anwendungen.

Abbildung 1. Aufbereitung von klinischen Proben. A) Feste Probe, die auf eine Petrischale mit 10 ml frischem, eiskaltem 1x PBS übertragen wird. B) Klinische Proben, die weiter in etwa 2 mm große Stücke geschnitten

Abbildung 2. Trennung von EOC-Zellen aus undissoziiertem Gewebe. Nach dem enzymatischen Aufschluss werden die klinischen Proben auf ein Zellsieb überführt und mit einem Spritzenkolben ein sanfter Druck auf die verdauten klinischen Proben ausgeübt. Dies ermöglicht die mechanische Ablösung von EOC aus dem Bindegewebe und die Rückgewinnung von EOC-Zellen

Abbildung 3. Beschichtung der resultierenden EOC-Zellensuspension. Nach der Entnahme von undissoziiertem Gewebe wird die Zellsuspension zentrifugiert und in 10 ml DMEM mit 10 % FBS resuspendiert und in einer Petrischale bei 5 % CO2 und 37 °C inkubiert