>1. Bildung von Sphäroiden in Eierstockkrebszellen
- RFP-exprimierende Eierstockkrebszellen werden in 10 % Basismedium kultiviert (ein spezielles Zellkulturmedium, das eine 50:50-Mischung aus 199 und MCDB105, 10 % inaktiviertes fötales Rinderserum und 1 % Pen-Streptokokken enthält). Um RFP in unmarkierten Eierstockkrebszellen zu exprimieren, transfizieren Sie die Zellen mit einem RFP-haltigen Plasmid und selektieren Sie nach Zellen, die RFP exprimieren. Alternativ können virale Vektoren verwendet werden, um fluoreszierende Proteine vorübergehend zu exprimieren, oder Zellen können mit einem rot fluoreszierenden Zelltracker-Farbstoff (Invitrogen) vorinkubiert werden.
- Vor der Bildung von Eierstockkrebs-Sphäroiden ist es notwendig, 96-Well-Kulturschalen mit rundem Boden mit geringer Adhäsion vorzubereiten. Um Kulturplatten mit geringer Adhäsion herzustellen, geben Sie 30 μl Poly-HEMA-Lösung (6 mg Polyhydroxyethylmethacrylat in 1 ml 95 % EtOH) in jede Vertiefung einer 96-Well-Zellkulturschale. Die 96-Well-Platten werden in einem 37 °C warmen, nicht befeuchteten Inkubator inkubiert, um das Ethanol zu verdampfen, wobei auf jeder Vertiefung ein Film aus Poly-HEMA verbleibt. Diese Poly-HEMA-Folie verhindert, dass sich Zellen am Boden der Vertiefung festsetzen, und zwingt die Zellen, in Suspension zu wachsen. [Alternativ können Ultra-Low Attachment Kulturplatten (Corning) verwendet werden.]
- Als nächstes trypsinisieren Sie Eierstockkrebszellen und pelletieren die Zellen in einer Tischzentrifuge (Heraeus) bei 900 RCF für 3 Minuten. Den Überstand aspirieren und in 10 % Base Medium resuspendieren.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
- Stellen Sie die Konzentration der Zellen so ein, dass 100 Zellen pro 50 μl 10 % Basismedium vorhanden sind.
- Geben Sie 50 μl der gleichmäßig suspendierten verdünnten Zellsuspension in jede Vertiefung der 96-Well-Poly-HEMA-beschichteten Kulturschale.
- Inkubieren Sie die 96-Well-Platte 16 Stunden lang in einem 37 °C-Zellkultur-Inkubator (diese Zeitspanne sollte je nach der Zeit, die eine bestimmte Zelllinie benötigt, um mehrzellige Sphäroide zu bilden, oder den gewünschten experimentellen Bedingungen erhöht oder verkürzt werden), damit sich die Eierstockkrebszellen zusammenballen und in jeder Vertiefung ein einzelnes mehrzelliges Sphäroid bilden können. Einige Tumorzellen können in dieser Zeit Apoptose durchlaufen, daher ist es wichtig, einen Zeitpunkt vor der Induktion der Apoptose zu wählen.
>2. Bildung von mesothelialen Zell-Monolagen
- Beschichten Sie in einer Zellkulturhaube die Vertiefungen einer 6-Well-MatTek-Schale mit Glasboden mit Fibronektin, indem Sie 2 ml einer 5 μg Fibronektin/ml-PBS-Lösung in jede Vertiefung der Schale geben und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Die optische Qualität der Glasböden in MatTek-Schalen ermöglicht eine hochauflösende mikroskopische Bildgebung.
- GFP-exprimierende Mesothelzellen werden in 10% Base Medium kultiviert. Trypsinisieren Sie eine Platte mit mesothelialen Zellen, schleudern Sie sie in einer Tischzentrifuge (Heraeus) bei 900 U/min für 3 Minuten, aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie ihn in 10 % Base Medium. Die hier verwendeten Mesothelzellen exprimierten bereits GFP, als sie gewonnen wurden, aber unmarkierte Mesothelzellen können durch Transfektion mit einem Plasmid, das GFP-cDNA enthält, oder durch Vorinkubation der Zellen in einem grün fluoreszierenden Zellverfolgungsfarbstoff (Invitrogen) hergestellt werden.
- Nach der 30-minütigen Fibronektin-Inkubation (in Schritt 2.1) waschen Sie die Vertiefungen der MatTek-Schale mit 2 mL PBS.
- Aspirieren Sie das PBS und die Platte 6 x 105 Mesothelzellen pro Vertiefung in jeder Vertiefung der 6-Well-MatTek-Schale. Inkubieren Sie die MatTek-Schale über Nacht in einem 37 °C heißen Zellkultur-Inkubator, damit sich die Mesothelzellen an der Schale anheften und eine Monoschicht bilden können.
>3. Assay zur Beseitigung von mesothelialen Zellen
- Verwenden Sie eine Pipette, um die Eierstockkrebs-Sphäroide von der 96-Well-Poly-HEMA-beschichteten Platte zu sammeln.
- Aspirieren Sie das Medium aus einer Vertiefung der 6-Well-MatTek-Schale, die eine mesotheliale Zellmonoschicht enthält. Einmal mit 2 mL PBS waschen. Fügen Sie alle Sphäroide aus der 96-Well-Platte in eine Vertiefung der MatTek-Schale hinzu (~3x die Anzahl der Sphäroide, die abgebildet werden sollen, um Sphäroide zu berücksichtigen, die auf dem Teil der Schale landen, der nicht abgebildet werden kann).
- Stellen Sie die MatTek-Schüssel auf den Tisch eines inversen Weitfeld-Fluoreszenzmikroskops, das mindestens 8 Stunden lang Zeitrafferaufnahmen durchführen kann. Verwenden Sie einen motorisierten Tisch, um mehrere Positionen in der Schale mit mehreren Sphäroid-Interkalationsereignissen in einem einzigen Experiment abzubilden. Wir verwenden ein Nikon Ti-E Invertiertes motorisiertes Weitfeld-Fluoreszenz-Zeitraffermikroskop mit integriertem Perfect Focus System und geringer [20x-0,75 numerischer Apertur (NA)] Vergrößerung/NA Differential Interferenzkontrast (DIC) Optik, einen Nikon Halogen-Transilluminator mit 0,52 NA Kondensor für lange Arbeitsabstände (LWD), Nikon schnelle (<100 Millisekunden Schaltzeit) Anregungs- und Emissionsfilter (GFP Ex 480/40, Em 525/50, RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50), Sutter schnelle Sende- und Epifluoreszenz-Lichtweg-Smart-Shutter, ein linear codierter motorisierter Tisch von Nikon, eine gekühlte CCD-Kamera (Charge-Coupled Device) von Hamamatsu, eine speziell angefertigte Mikroskop-Inkubationskammer mit Temperatur- und CO2 -Regelung, die Nikon NIS-Elements AR-Software Version 3 und ein TMC-Schwingungsisolationstisch.
- Die Sphäroide der Eierstockkrebszellen setzen sich am Boden der Schale ab und heften sich an die Monoschicht der Mesothelzellen. Sammeln Sie GFP-, RFP- und Phasenbilder von 20+ Sphäroid-/Monolayer-Wechselwirkungen alle 10 Minuten, 8 Stunden lang.
- Die RFP-exprimierenden Sphäroide der Eierstockkrebszellen dringen in die GFP-exprimierende Mesothelzell-Monoschicht ein und erzeugen ein Loch in der Monoschicht. Messen Sie nach 8 Stunden die Größe der Löcher, indem Sie die schwarzen Löcher in den GFP-Bildern mit der Elements-Software (oder einer anderen geeigneten Software wie Bild J) nachzeichnen. Normalisieren Sie die Lochgröße auf die ursprüngliche Sphäroidgröße, indem Sie die Lochgröße nach 8 Stunden durch die Größe des Sphäroids im entsprechenden RFP-Bild zum Zeitpunkt Null dividieren. In diesem Beispiel wurde die Lochgröße nur einmal gemessen, aber sie kann während des achtstündigen Experiments mehrmals gemessen werden, um die Dynamik der Interkalation besser zu verstehen.
