Bestimmung der optimalen Feldfrequenz für die inhibitorische Tumorbehandlung von Krebszellen: Eine nicht-invasive In-vitro-Methode zur Bewertung der Wirkung von TTFields auf die Lebensfähigkeit von Krebszellen

>1. TTFields In-vitro-Applikationssystem - Wartung von Bodenplatte und Schale

1. Spülen Sie Geschirr und Geschirrabdeckungen unter fließendem Leitungswasser ab. Dann mit entionisiertem Wasser abspülen und mit der Vorderseite nach unten an der Luft trocknen.
2. Wenn in einem früheren Experiment ein Chemotherapeutikum / Medikament zu Geschirr hinzugefügt wurde, füllen Sie jede Schale mit einer 5%igen leichten Waschmittellösung und lassen Sie es über Nacht stehen.
   1. Spülen Sie das Geschirr gründlich unter fließendem Leitungswasser ab, um Spuren von Spülmittel im Inneren des Geschirrs zu vermeiden. Spülen Sie das Geschirr und die Geschirrdeckel mit entionisiertem Wasser ab und trocknen Sie es mit der Vorderseite nach unten an der Luft.
3. Legen Sie das saubere und trockene Geschirr mit seinen Abdeckungen in Sterilisationsbeutel. Verschließen Sie die Beutel und legen Sie sie mit dem Geschirr nach unten in einen Autoklaven. 30 Minuten lang bei nicht mehr als 121 °C autoklavieren.
4. Stellen Sie den Autoklaven auf ein Trockenprogramm, öffnen Sie die Autoklaventür teilweise und trocknen Sie das Geschirr 30 Minuten lang.
5. Wischen Sie die Grundplatte mit einem leicht mit 70 % Ethanol angefeuchteten Tuch ab.

>2. Aufbau des Experiments

HINWEIS: Alle Geräte und Materialien, die in diesem Protokoll verwendet werden, sind in der Materialliste beschrieben. Alle folgenden Schritte sollten in einem Laminar-Flow-Schrank unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.

1. Bereiten Sie saubere und sterile TTFields-Schalen und -Abdeckungen vor, wie in Abschnitt 1 beschrieben. Wischen Sie die Grundplatte mit einem leicht mit 70 % Ethanol angefeuchteten Tuch ab.
2. Setzen Sie die TTFields-Schalen mit den Deckeln auf die Bodenplatte, indem Sie die Schale leicht nach unten drücken und um ca. 5 mm im Uhrzeigersinn drehen, bis der Rand der Schale an den drei Stiften auf der Bodenplatte einrastet. Legen Sie ein steriles 22-mm-Deckglas (behandelter Kunststoff oder Glas) auf den Boden jeder Schale.
3. Bereiten Sie die Zellsuspension in vollständigem Wachstumsmedium vor (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium für U-87 MG und F98; RPMI für A2780 und OVCAR-3; ergänzt wie in der Materialliste beschrieben).
   HINWEIS: Die Zellkonzentrationen sind abhängig von den Zelltypen und der Versuchsdauer; 80%-90% konfluentes Zellwachstum sollten am Ende des Experiments nicht überschritten werden.
   VORSICHT: Menschliche Zelllinien können eine biologische Gefahr darstellen und sollten mit den entsprechenden Sicherheitsmaßnahmen behandelt werden.
4. Geben Sie 200 μl Zellsuspension (normalerweise 5.000-20.000 Zellen in 200 μl für ein 72-stündiges Experiment, abhängig von der Verdopplungszeit) als Tropfen in die Mitte jedes Deckglases und decken Sie es mit den Schalendeckeln ab.
5. Inkubieren Sie bei 37 °C in einem CO₂ -Inkubator, bis die Zellen anhaften; eine Inkubation über Nacht ist in diesem Stadium möglich.
6. Saugen Sie die Flüssigkeiten mit einer 200- oder 1.000-μl-Pipette aus dem Tropfen ab.
7. Pipettieren Sie vorsichtig 2 ml vollständiges Wachstumsmedium, um jede Schale zu füllen. Verwenden Sie eine sterile Spitze zum Pipettieren und klopfen Sie sanft auf die Ränder des Deckglases, um die Luftblasen freizusetzen, die sich gelegentlich unter dem Objektträger verfangen haben.
8. Decken Sie die Schalen mit dem Deckel ab und stellen Sie sie bis zum Beginn der TTFields-Behandlung bei 37 °C in einen CO₂ -Inkubator.

>3. TTFields-Anwendung

1. Übertragen Sie die Bodenplatten mit den beigefügten TTFields-Schalen in einen gekühlten CO₂ -Inkubator.
   HINWEIS: Die In-vitro-Anwendung von TTFields erzeugt Wärme; Daher ist ein Kühlbrutschrank erforderlich, um die Erwärmung der Speisen auszugleichen. Höhere TTFields-Intensitäten erzeugen mehr Wärme und erfordern niedrigere Umgebungstemperaturen des Inkubators (siehe Tabelle 1). Klinisch relevante TTFields-Intensitäten werden erreicht, wenn die Inkubatortemperatur für die TTFields-Anwendung im Bereich von 18-30 °C liegt.
2. Verbinden Sie die Flachkabel-Buchse mit der Grundplatte. Schalten Sie den TTFields-Generator ein.
3. Starten Sie die TTFields in vitro Application Systemsoftware und wählen Sie die Versuchseinstellungen aus.
   1. Definieren Sie ein neues Experiment. Geben Sie den Namen des Experiments und den Besitzer des Experiments in die Benutzeroberfläche der Software auf dem Computerbildschirm ein. Passen Sie die Frequenz und die Zieltemperatur für jede Schüssel oder Bodenplatte an.
4. Starten Sie die TTFields-Anwendung mit der Software.
5. Vergewissern Sie sich, dass alle Schüsseln richtig angeschlossen sind und auf dem Monitor hellblau angezeigt werden. Wenn eine Schale mit einem roten Rahmen eingekreist ist (was bedeutet, dass sie nicht richtig angeschlossen ist), drücken Sie sie leicht nach unten und drehen Sie sie langsam hin und her, bis die Kontakte wiederhergestellt sind und die Schale hellblau erscheint.
6. Lassen Sie das TTFields In-vitro-Applikationssystem bis zu 24 h laufen.
7. Wenn das Experiment sein Ende erreicht, stoppen Sie das Experiment, indem Sie in der Software auf die Schaltfläche EXPERIMENT BEENDEN klicken und mit Schritt 5 fortfahren. Wenn nicht, klicken Sie auf EXPERIMENT PAUSE.
8. Trennen Sie den Flachkabelstecker von der Grundplatte. Nehmen Sie die Grundplatte mit den Schalen aus dem Inkubator in einen Laminar-Flow-Schrank.
9. Wechseln Sie das Medium in allen Schalen alle 24 h und stellen Sie die Bodenplatte wieder in den Kühlbrutschrauch. Verbinden Sie die Grundplatte mit dem Flachbandkabel mit dem Generator. Setzen Sie das Experiment fort, indem Sie auf die Schaltfläche WEITER klicken.

Tabelle 1. Umgebungstemperatur des Inkubators und erwartete TTFields-Intensitäten in der TTFields-Schale.

>4. Kontroll-Stichproben

Hinweis: Züchten Sie Kontrollzellen unter ähnlichen Bedingungen wie TTFields-behandelte Zellen, ohne TTFields-Anwendung.

1. Kontrollproben werden mit der gleichen Suspension und auf einer ähnlichen Oberfläche plattiert, die für die Beschichtung von TTFields-behandelten Proben verwendet wird.
2. Stellen Sie die Kontrollschalen in einen CO₂ -Inkubator bei 37 °C.
3. Tauschen Sie das Medium alle 24 Stunden in den Schalen aus, um es an die Bedingungen des TTFields-behandelten Mediums anzupassen.

>5. Ende des Experiments

1. Nachdem Sie auf EXPERIMENT BEENDEN geklickt haben, warten Sie, bis die Software alle Datensätze vom System abgerufen und auf dem Computer gespeichert hat.
2. Verwenden Sie die Schaltfläche BERICHTE, um die Temperatur-, Strom- und Widerstandsprotokolldateien jeder Grundplatte zu überprüfen und sicherzustellen, dass alle Schalen gemäß dem Versuchsplan behandelt wurden.
   HINWEIS: Alle Berichte und Protokolle werden nach Beendigung des Experiments auf dem Computer gespeichert und können jederzeit überprüft werden.
3. Schalten Sie den TTFields-Generator aus.
4. Trennen Sie das Flachbandkabel von der Grundplatte und nehmen Sie es aus dem Inkubator.
5. Um eine Keramikschale zu entfernen, drücken Sie die Schale nach unten und drehen Sie sie gegen den Uhrzeigersinn, um sie von der Bodenplatte zu entriegeln.
6. Bringen Sie das Geschirr in einen Laminar-Flow-Schrank und entfernen Sie die Deckgläser aseptisch. Übertragen Sie sie zur weiteren Inspektion und Bewertung in sterile Petrischalen mit frischem Medium oder phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).