$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Alle Eingriffe mit Hühnerei-Embryonen wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Zubereitung der Eier
- Bevor Sie die Eier erhalten, montieren Sie den Eierbrutkasten und äquilibrieren Sie ihn auf 37,8 °C (100 °F) bei 60-70 % Luftfeuchtigkeit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Anmerkung: Um das Kontaminationsrisiko zu minimieren, kann autoklaviertes Wasser verwendet werden, um die Luftfeuchtigkeit zu kontrollieren.
- Wenn Sie befruchtete Rhode Island Red Hühnereier von einem zertifizierten Eierlieferanten in Laborqualität erhalten, wischen Sie die Oberfläche der Schalen mit Papiertüchern trocken. Ein leicht angefeuchtetes Papiertuch kann verwendet werden, um anhaftendes Material zu entfernen. Sofort trocknen.
Anmerkung: Das Benetzen der Schale mit Flüssigkeit unter 43,3 °C kann dazu führen, dass Bakterien in das Ei gelangen. Wenn man sich dafür entscheidet, die Eier zu waschen oder zu desinfizieren, muss die Temperatur der Flüssigkeit zwischen 43,3 und 48,9 °C liegen. Höhere Temperaturen können die Eier zum Kochen bringen. Die Wahl des Desinfektionsmittels sollte auf der Grundlage der besorgniserregenden Mikroorganismen getroffen werden.
- Verwende einen Bleistift oder Marker, um das Datum auf dem Ei zu beschriften. Dies wird als Entwicklungstag 0 betrachtet.
- Legen Sie die Eier in den Ei-Inkubator und inkubieren Sie sie mindestens 7 Tage lang mit Rotation, um die CAM-Entwicklung zu ermöglichen. Es kann ein automatischer Rotator verwendet werden, oder die Eier können 2-3x pro Tag um 180° gedreht werden.
>2. Öffnen der Eier
HINWEIS: Das Öffnen der Eier sollte erfolgen, wenn sich das CAM vollständig entwickelt hat. Dies ist in der Regel am 7. oder 8. Entwicklungstag der Fall.
- Desinfizieren Sie eine Biosicherheitswerkbank mit 70% Ethanol. Desinfizieren Sie auf ähnliche Weise ein Eierregal, einen Eierkerzenhalter, einen Marker, ein kabelloses Rotationswerkzeug mit einem Siliziumkarbid-Schleifstein und einer kreisförmigen Trennscheibe, eine 18-G-Nadel, eine Pipettensteuerung mit einem Viertelzoll-Vakuumschlauch, ein Packband, eine Büroschere, eine gebogene Schere, eine Semken-Pinzette (oder ähnliche), Wattebällchen und einen 6 x 7 cm großen transparenten Folienverband und legen Sie sie in die Biosicherheitswerkstatt. Verwenden Sie nach Möglichkeit sterile, Einweg- oder autoklavierte Werkzeuge.
- Schalten Sie den Eierrotator aus. Legen Sie ca. 1-3 Eier in die Biosicherheitswerkbank auf dem Eiergitter. Wenn du im Dunkeln bist, lege den Egg Candler gegen die Eierschale, um die Luftzelle zu identifizieren. Markieren Sie den Standort der Luftzelle.
Anmerkung: Die Intensität der Beleuchtung durch den Egg Candler ist entscheidend für die Visualisierung des Inneren des Eies. Wenn die Luftzelle oder das Gefäßsystem ständig schwer zu sehen ist, versuchen Sie, die Batterien des Egg Candlers auszutauschen.
- Bewege den Egg Candler über die Schale, um ein großes Blutgefäßnetzwerk zu finden. Drehen Sie das Ei bei Bedarf. Ein ideales Gefäßsystem verzweigt sich in der Nähe der Mitte des Eies. Zeichnen Sie mit einem Marker über das Gefäßsystem, das für die Implantation verwendet werden soll.
- Schalten Sie das Licht in der Motorhaube ein. Bohren Sie mit einem Akku-Rotationswerkzeug, das mit einem Siliziumkarbid-Schleifstein ausgestattet ist, ein kleines Loch in die Schale direkt über der Mitte der Luftzelle. Bohren, bis der größte Teil der Schale entfernt wurde, aber die weiße, innere Membran intakt ist.
Anmerkung: Das Bohren über die Luftzelle, bevor es auf das Gefäßsystem abzielt, ermöglicht es, die Dicke dieser speziellen Eierschale über der Luftzelle und nicht über dem CAM und dem Gefäßsystem zu bestimmen. Wenn die CAM oder das Gefäßsystem gestört ist, ist die Eizelle für die Implantation nicht verwendbar.
- Bohren und öffnen Sie ein weiteres kleines Loch, in dem das Gefäßfenster geöffnet wird, wie es bei der Luftzelle (Schritt 2.4) der Fall war.
- Mit einer 18 G Nadel stechen Sie vorsichtig durch die weiße, innere Membran über der Luftzelle und dem Gefäßsystem. Wenn es nicht möglich ist, die Schale zu durchdringen, bohren Sie vorsichtig noch ein wenig mehr. Stellen Sie sicher, dass die weiße, innere Membran (aber nicht das CAM) über den gesamten Bohrbereich unterbrochen wird. Ein Entfernen des Membranstücks ist nicht erforderlich.
Anmerkung: Wenn das CAM oder das Gefäßsystem während dieses Schritts gestört wird, entsorgen Sie die Eizelle. Ein Schaden ist offensichtlich, wenn Blut oder Albumin aus einem Bohrloch austritt.
- Schalten Sie das Motorhaubenlicht aus. Überprüfen Sie mit dem Egg Candler, ob die Luftzelle vom Ende des Eies in den Bereich über dem Gefäßsystem übertragen wurde. Platzieren Sie bei Bedarf den in eine Pipettierhilfe eingeführten Vakuumschlauch um das Loch über der ursprünglichen Luftzelle und üben Sie in kurzen Stößen vorsichtig einen Sog aus, um die Luftzelle zu bewegen.
- Verwenden Sie eine Markierung, um die neue Position der Luftzelle etwa 0,5 cm innerhalb der air-CAM-Begrenzung zu umreißen. Kleben Sie ein Stück Packband direkt über die neue Luftzelle. Verwenden Sie ggf. eine handelsübliche Büroschere, um das Band auf eine geeignete Größe zu kürzen.
Anmerkung: Das Klebeband kann den Luftstrom durch die Schale unterbrechen und sollte nicht größer als nötig sein, um die Luftzelle vollständig abzudecken.
- Stellen Sie die Eier wieder in den Inkubator, um sie ohne Rotation mit der neuen Luftzelle nach oben zu erwärmen. Wiederholen Sie die Schritte 2.2-2.9, bis die restlichen Eier geöffnet werden sollen.
Anmerkung: Das Protokoll kann hier pausiert werden. Wenn Sie sich über die Qualität der CAM-Entwicklung nicht sicher sind, sollte eine kleine Anzahl von Eizellen Schritt 2.16 durchlaufen, bevor die verbleibenden Eizellen geöffnet werden.
- Legen Sie ca. 1-3 Eier mit umgelagerten Luftzellen auf den Eierständer in der Biosicherheitswerkbank.
Anmerkung: Es sollte darauf geachtet werden, dass keine Kontamination in das geöffnete Ei gelangt. Öffnen Sie daher Eier immer in einer Biosicherheitswerkbank und verwenden Sie nach Möglichkeit sterile Werkzeuge und Geräte.
- Schneiden Sie mit einem Akku-Rotationswerkzeug, das mit einer kreisförmigen Trennscheibe ausgestattet ist, eine kleine Linie über die in Schritt 2.8 gezeichnete Luftzellengrenze. Stellen Sie sicher, dass diese ca. 0,5 cm innerhalb der tatsächlichen air-CAM-Grenze liegt, um eine Störung des CAM oder des Gefäßsystems zu vermeiden. Schneiden Sie die Schale vollständig durch, aber achten Sie darauf, nicht tief genug einzudringen, um das CAM oder das Gefäßsystem zu stören.
- Schneiden Sie mit einer gebogenen Schere um die verbleibende Luftzelle herum, um ein Fenster in der Schale zu schaffen.
Anmerkung: Wenn Blut oder Membran auf der entfernten Schale vorhanden ist, ist die Eizelle nicht für die Implantation geeignet. Wenn ein hoher Anteil der Eizellen nicht sauber geöffnet wird, sollten Sie mindestens 1 zusätzlichen Tag warten, um die verbleibenden Eizellen zu öffnen, um eine bessere CAM-Bildung zu ermöglichen. Wenn die Schalen der verbleibenden Eier nicht durchstochen wurden, sollte die Rotation der Eier im Brutapparat fortgesetzt werden.
- Überprüfen Sie die Lebensfähigkeit des Embryos. Lebensfähige Embryonen weisen ein ausgedehntes Gefäßsystem, klares Albumin, eine Embryonenbewegung oder einen sichtbaren Herzschlag auf.
- Ziehen Sie mit einer Semken-Pinzette kleine Wattestücke aus einem sterilen Wattebausch. Tupfen Sie die CAM-Oberfläche vorsichtig ab, um den Schalenstaub und Schmutz zu entfernen.
Anmerkung: Die Entfernung von Ablagerungen muss am selben Tag erfolgen, an dem die Eizellen geöffnet werden.
- Decken Sie die Schalenöffnung mit einem Viertel Stück 6 x 7 cm transparenter Folienzurichtung ab.
- Lege die Eier wieder in den Brutkasten. Stellen Sie sicher, dass das Ei mit dem geöffneten Fenster nach oben sicher sitzt und das CAM den transparenten Folienverband nicht berührt. Verwende ein Stück Eierregal, die Kante des Eierrotators oder einen anderen geeigneten Gegenstand, um Eier abzustützen, die weiterrollen.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.10-2.16 für alle restlichen Eier, die geöffnet werden sollen.
Anmerkung: Die Öffnung der Eizellen muss nicht am selben Tag wie die Implantation abgeschlossen sein. Wenn Sie mindestens 1 Tag warten, können Sie Eier entfernen, deren Lebensfähigkeit durch das Öffnen der Schale beeinträchtigt wurde.