Chorioallantoische Membran-basierte Krebsmodellierung bei Hühnern: Ein In-Ovo-Modell zur Untersuchung der Tumorgenese und Metastasierung von Krebszellen

Zusammenfassung

Quelle: Sharrow, A. C. et al. Verwendung des In-vivo-Modells der Hühner-Chorioallantoikmembran zur Untersuchung gynäkologischer und urologischer Krebserkrankungen. J. Vis. Exp.(2020)

In diesem Video beschreiben wir die Implantation von Krebszellen auf eine Chorioallantoismembran eines Huhns, um ein In-Ovo-Modell zu erstellen. Das Modell transplantiert erfolgreich Eierstockkrebszellen, um das Fortschreiten von gynäkologischen Krebserkrankungen zu untersuchen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Vorbereitung der Krebszellsuspension für die Transplantation (Option 1)

HINWEIS: Dies muss kurz vor der Implantation abgeschlossen werden, die idealerweise zwischen Tag 7 und 10 stattfinden sollte. Bitte beachten Sie die Hinweise zu Beginn von Schritt 3 oder 4 für weitere Informationen zum Einnistungsdatum. Dieser Ansatz wurde für alle Zelllinien und kultivierten Nierenkrebstumorverdaue verwendet.

1. Tauen Sie die extrazelluläre Matrixlösung auf Eis auf.
2. Durch mechanischen und/oder enzymatischen Aufschluss wird eine Einzelzellsuspension mit einer für den zu implantierenden Zelltyp geeigneten Methode gewonnen.
3. Die Gesamtzahl der zu implantierenden Zellen wird in ein geeignetes Medium für die Implantation resuspendiert. Typisch sind Implantate von 1-2 x 10⁶ Zellen pro Eizelle.
   Anmerkung: Das Medium, das für die Implantation der Zelllinien verwendet wird, ist typischerweise das vollständige Medium, das für die Kultivierung der Zellen verwendet wird und FBS oder Serumersatz enthält. Bei der Implantation von Tumorverdauen wird in der Regel das komplette Medium verwendet, das für die Kultivierung von Zelllinien desselben Krebstyps verwendet wird. Bei experimentellem Bedarf können jedoch Anpassungen an der Mediumsformulierung vorgenommen werden. Die Auswirkungen auf die Tumorentwicklung und das Tumorwachstum müssten empirisch ermittelt werden.
4. Pelletieren Sie die Zellen mit einer Zentrifugengeschwindigkeit und -zeit, die für die verwendeten Zellen geeignet sind. Typische Geschwindigkeiten sind 250-300 x g und Zeiten sind 5-10 min.
5. Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren aus den pelletierten Zellen. Resuspendieren Sie die Zellen mechanisch im Restmedium durch Schnippen oder Pipettieren. Zum Abkühlen auf Eis legen. Messen Sie das Volumen der Zellen und des Mediums mit einer Pipette geeigneter Größe.
6. Berechnen Sie das Implantationsvolumen so, dass 1-2 x 10⁶ Zellen in einem Volumen von 20-100 μl pro Ei mit einer endgültigen extrazellulären Matrixkonzentration von 2,7-4 mg/ml Protein implantiert werden. Entsprechend dieser Berechnung werden Medium, gewünschte Wachstumsfaktoren oder Zusatzstoffe und extrazelluläre Matrixlösung zugegeben. Bis zur Implantation auf Eis halten.
   Anmerkung: Für die Berechnungen in den Schritten 1.3 und 1.6 sollte ein zusätzliches Volumen von mindestens einer halben Eiimplantation eingearbeitet werden, um ein ausreichendes Volumen für alle Eizellen in der Gruppe zu gewährleisten. Für die Implantation der Zelllinien des Eierstockkrebses (d.h. SKOV3 und ID8) wurden 10⁶ Zellen pro Eizelle implantiert. Für die Implantation der Nierenzellkarzinom-Zelllinie RENCA wurden kultivierte Zellen, die aus verdauten primären humanen Nierenzellkarzinomen, Prostatakrebs-Zelllinien (d. h. CWR, C4-2 und MyC-CaP) und Blasenkrebs-Zelllinien (d. h. HT-1376 und T24) stammen, 2 x 10⁶ Zellen implantiert.

>2. Vorbereitung von Tumorstücken für die Implantation (Option 2)

HINWEIS: Dies muss kurz vor der Implantation abgeschlossen werden, die idealerweise zwischen Tag 7 und 10 stattfinden sollte. Bitte beachten Sie die Hinweise zu Beginn von Schritt 3 oder 4 für weitere Informationen zum Einnistungsdatum. Primärer Ovarial- und Blasenkrebs wurden als Tumorstücke implantiert.

1. Extrazelluläre Matrixlösung auf Eis auftauen. Auf eine Proteinendkonzentration von 2,7-4 mg/ml in einem geeigneten Medium verdünnen, das die gewünschten Wachstumsfaktoren oder Zusatzstoffe enthält. Bleiben Sie auf Eis.
   Anmerkung: Bei der Implantation von Tumorstücken wird in der Regel das komplette Medium verwendet, das für die Kultivierung von Zelllinien desselben Krebstyps verwendet wird. Anpassungen an der Mediumformulierung können jedoch bei Bedarf experimentell vorgenommen werden. Die Auswirkungen auf die Tumortransplantation und das Tumorwachstum müssten empirisch bestimmt werden.
2. Schneiden Sie mit einem Skalpell oder einer Schere Stücke aus dem frischen Tumor heraus. Die idealen Größen reichen von 2-5 mm auf jeder Seite. Lassen Sie das Gewebe bis zur Implantation in das Medium eintauchen.

>3. Implantation mit einem Antihaftring (Option 1)

HINWEIS: Zellen können ab Entwicklungstag 7 implantiert werden, wenn das CAM vollständig entwickelt ist. Die Implantation kann jederzeit vor dem Schlüpfen erfolgen, was ausreichend Zeit für die Tumorentwicklung und das gewünschte Experiment lässt, aber beachten Sie, dass die Immunzellen des Embryos etwa am 10. Tag nach der Befruchtung vorhanden sind. Die Tumorwachstumsrate variiert je nach Zelltyp erheblich und muss für den interessierenden Zelltyp empirisch bestimmt werden. Die Eierstockkrebs- und die Prostatakrebszellen wurden mit der Antihaftringmethode implantiert. Beachten Sie, dass, wenn kein Antihaftring verfügbar ist, eine Pipettenspitze auf eine ähnliche Größe zugeschnitten und verwendet werden kann.

1. Verwenden Sie 70%iges Ethanol zur Desinfektion einer Biosicherheitswerkbank und aller erforderlichen Werkzeuge: ein Eiergitter, eine gebogene Iriszange, Antihaftringe (1/4 Zoll Innendurchmesser), einen Rührstab aus Glas, Pipetten und Spitzen mit entsprechendem Volumen, einen 6 x 7 cm großen transparenten Filmverband, eine Büroschere und einen Marker oder Bleistift. Wann immer möglich, sollten sterile, Einweg- oder autoklavierte Werkzeuge verwendet werden.
2. Legen Sie die zu implantierenden Eier auf ein Eiergestell in einer Biosicherheitswerkbank. Wählen Sie eine überschaubare Anzahl an Eiern aus. Bis zu sechs sind typisch. Vermeiden Sie es, die Eier während der Arbeit stark abkühlen zu lassen.
3. Entfernen Sie den transparenten Folienverband von der Schale, indem Sie die Ränder zum offenen Fenster hin rollen, um ein Abreißen von Schalenstücken zu vermeiden. Überprüfen Sie, ob die Eier lebensfähig und gesund sind. Ideale Eier haben ein großes Gefäß in der Mitte des geöffneten Bereichs, von dem kleinere Gefäße abzweigen.
4. Platzieren Sie mit einer gebogenen Irispinzette einen sterilen, antihaftbeschichteten Ring auf dem CAM über dem Gefäß, idealerweise über einer Abzweigstelle. Verwenden Sie einen sterilen Rührstab aus Glas, um den CAM vorsichtig abzuschleifen.
5. Pipettieren Sie die Zellsuspension aus Schritt 1.6 in die Mitte des Antihaftrings. Alternativ können Sie ein Tumorstück aus Schritt 2.2 mit einer Pinzette in die Mitte des Antihaftrings einführen und mit 20-50 μl der in Schritt 2.1 erzeugten extrazellulären Matrixlösung bedecken.
6. Verschließen Sie die Öffnung mit einem Viertel Stück 6 x 7 cm Klarsichtfolie. Beschriften Sie die Eizellen mit einer entsprechenden Implantatbezeichnung.
   Anmerkung: Die Nummerierung der Eier innerhalb einer Gruppe erleichtert Längsschnittbeobachtungen.
7. Lege das Ei wieder in den Brutkasten. Achten Sie darauf, dass die Öffnung der Schale aufrecht sitzt und das Ei sicher sitzt.
   Anmerkung: Die Eizellen können ohne Rotation in einen Eierbrutkasten zurückgelegt werden. Alternativ kann eine hohe postimplantative Lebensfähigkeit mit einem 37-38 °C Zellinkubator erreicht werden, bei dem das CO_{2 deaktiviert} ist, und einem Hygrometer zur Überwachung der Luftfeuchtigkeit, die 50 % bis 80 % betragen sollte.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
010 Teflon (PTFE) Weiß 55 Duro Shore D O-Ringe	Der O-Ring Store	TEF010	Antihaftring für die Zellaussaat. 1/4" ID X 3/8" OD X 1/16" CS Polytetrafluorethylen (PTFE).
empfindliche Bedienungsschere; Gekrümmt; Scharf-Scharf; 30 mm Klingenlänge; 4-3/4 Zoll Gesamtlänge	Roboz Chirurgisch	RS6703	Dies wird als Beispiel angegeben. Jede ähnliche gebogene Schere würde auch funktionieren.
Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max Werkzeugsatz	Dremel	8050-N/18	Dieses Set enthält alle notwendigen Werkzeuge
Befruchtete Hühnereier (Rhode Island Rot - Braun, Laborqualität)	AA Laboreier Inc.	N/A	Es müsste ein lokaler Eierlieferant identifiziert werden, da dieser Lieferant nur regional liefert.
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Brutkasten Kombi-Set	Inkubator-Lager	HB1588D-NONE-1102-1588-1357	Es können auch andere Brutschränke verwendet werden, deren Zuverlässigkeit jedoch überprüft werden müsste. Nach der Implantation kann auch ein Zellinkubator mit deaktiviertem CO2 verwendet werden.
Incu-Bright Cool Light Egg Candler	Inkubator-Lager	Nr. 1102	Es können auch andere Candler verwendet werden, die jedoch von den von uns getesteten bevorzugt werden. Dieser Candler ist im oben genannten Inkubator-Kit enthalten.
Matrigel Membran Matrix HC; LDEV-frei	Corning	354248	Extrazelluläre Matrixlösung
SKOV3	ATCC	HTB-77	Humane Eierstockkrebs-Zelllinie.
Rührstäbe mit Gummi Policeman; 5 mm Durchmesser, 6 Zoll Länge	United Scientific Supplies	GRPL06	Dies wird als Beispiel angegeben. Alle ähnlichen Rührstäbchen aus Glas würden auch funktionieren.
Zange für Proben	Elektronenmikroskopie	Artikel-Nr.: 72914	Dies wird als Beispiel angegeben. Die Pinzette, mit der die Schale für die Biolumineszenz-Bildgebung abgezogen wird, ist ca. 12,8 cm lang und hat 3 mm breite Spitzen.