Agarose-Spin-Down-Assay: Eine Technik zur Einbettung von Organoiden für die histologische Analyse

>1. Organoid-Verarbeitung für die Histologie: Die Agarose-Spin-Down-Methode

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde von einer früheren Veröffentlichung von Vlachogiannis et al. übernommen. Wir haben einen Schritt hinzugefügt, der die Agarose-Einbettung beinhaltet, um alle Populationen von Organoiden erfolgreich einzubetten.

1. Entfernen Sie vorhandene Medien aus der Vertiefung. Achten Sie darauf, die Basalmembrankuppeln nicht abzusaugen.
2. Geben Sie ein gleiches Volumen der Zellrückgewinnungslösung hinzu (entspricht dem Volumen des in Schritt 1 entnommenen Mediums) und inkubieren Sie es 60 Minuten lang bei 4 °C.
3. Lösen Sie die Basalmembrankuppel mit einer Pipette und zerdrücken Sie die Basalmembrankuppel mit einer Pipettenspitze. Sammeln Sie die dissoziierte Dome und die Zellrückgewinnungslösung in einem 1,5-ml-Röhrchen.
4. Zentrifugieren Sie bei 300 x g und 4 °C für 5 min.
5. Entfernen Sie den Überstand (Zellrückgewinnungslösung). Bewahren Sie alle Überstände bis zum Ende in getrennten Röhrchen auf, wenn das Vorhandensein von Organoiden im letzten Pelletierungsschritt bestätigt wird.
6. Fügen Sie das gewünschte Volumen (Tabelle 1) kaltes PBS hinzu und pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um das Pellet mechanisch zu stören.
7. Zentrifugieren Sie bei 300 x g und 4 °C für 5 min.
8. Entfernen Sie den Überstand (PBS).
9. Fixieren Sie das Pellet 60 Minuten lang bei Raumtemperatur in einem abgestimmten Volumen (z. B. 500 μl für ein Pellet aus der 24-Well-Plattenkultur, Tabelle 1) mit 4 % PFA.
10. Nach der Fixierung bei 300 x g und 4 °C 5 min zentrifugieren.
11. Entfernen Sie den Überstand (PFA).
12. Mit angepasstem Volumen (z. B. 500 μl für ein Pellet aus der 24-Well-Plattenkultur, Tabelle 1) von PBS waschen und bei 300 x g und 4 °C für 5 Minuten zentrifugieren.
13. Bereiten Sie warme Agarose zu (2 % Agarose in PBS).
    Anmerkung: Hier können Zellpellets für den Gefrierbereich direkt in 200 μl OCT-Verbindung resuspendiert werden.
14. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 μl Agarose (2% in PBS).
    1. Unmittelbar nach der Zugabe von Agarose lösen Sie das Zellpellet vorsichtig von der Wand des 1,5-ml-Röhrchens mit der 25-G-Nadel, die an der 1-ml-Spritze befestigt ist. Wie in Abbildung 1 gezeigt, besteht die Gefahr, dass das Zellpellet während des Agarose-Einbettungsprozesses ganz oder teilweise verloren geht, wenn das Zellpellet nicht physisch von der Wand des 1,5-ml-Röhrchens gelöst wird.
15. Warten Sie, bis die 2% Agarose in PBS vollständig verfestigt sind.
16. Lösen Sie den erstarrten Agaroseblock von der 1,5-ml-Tube mit einer 25-G-Nadel, die an der 1-ml-Spritze befestigt ist.
17. Übertragen Sie den abgelösten Agaroseblock mit dem Zellpellet in ein neues 1,5-ml-Röhrchen.
18. Füllen Sie das Röhrchen mit 70 % EtOH und fahren Sie mit dem herkömmlichen Protokoll zur Gewebedehydrierung und Paraffineinbettung fort.

Tabelle 1: Aussaatdichte, Volumen der Basalmembran und mittleres Volumen, das für eine Kuppel benötigt

Abbildung 1: Ein wichtiger Schritt für eine erfolgreiche Agarose-Einbettung. Ein Verfahren, um das Zellpellet von der Wand des 1,5-ml-Röhrchens zu lösen.