>1. Plattierung sortierter Prostata-Epithelzellen in primäre Maus-Organoidkultur — TIMING: 2-3 h (ausgenommen Poly-HEMA-beschichtete Plattenvorbereitung)
HINWEIS: Die Platten sind mit Poly-HEMA beschichtet, um die Bildung von 2D-Kolonien auf der Oberfläche der Vertiefung unter dem Matrixgel zu verhindern. Bereiten Sie Poly-HEMA-beschichtete Platten 1 Tag vor der Beschichtung sortierter basaler oder luminaler Prostataepithelzellen in Maus-Organoidkulturen vor. 1 ml Aliquots des Matrixgels mit reduziertem Wachstumsfaktor, im Folgenden als Matrixgel bezeichnet, 2 h vor Schritt 1.1 auf Eis auftauen. Y-27632 (ROCK-Inhibitor) sollte unmittelbar vor Schritt 1.1 zu Organoidmedien der Maus hinzugefügt werden. Führen Sie die Schritte 1.1-1.8 auf Eis aus.
- Die Zellen werden in 5 mL Rundbodenröhrchen durch Zentrifugation bei 800 x g für 5 min bei 4 °C pelletiert und der Überstand aspiriert.
- Waschen Sie das Zellpellet in 500 μl Maus-Organoidmedien (Tabelle 1).
- Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 800 x g für 5 min bei 4 °C pelletiert und der Überstand aspiriert.
- Resuspendieren Sie in Maus-Organoidmedien bei einer Zelldichte von 1.000 Zellen/μl.
- Um Mastermixe herzustellen, mischen Sie Epithelzellen, die in Maus-Organoidmedien suspendiert sind, mit Matrixgel, um eine endgültige Mischung zu erzeugen, die 25 % Zellen/Medien und 75 % Matrixgel enthält. Basalzellen werden typischerweise mit einer Konzentration von 100-2.000 Zellen/80 μl plattiert, während luminale Zellen typischerweise mit einer Konzentration von 2.000-10.000 Zellen/80 μl plattiert werden. Die Dichte der plattierten Zellen variiert je nach Tag der erwarteten Materialsammlung und der gewünschten nachgelagerten Anwendung.
HINWEIS: Kühlen Sie die Tube(s) in geeigneter Größe für das erwartete Mastermix-Volumen 5 Minuten vor der Mastermix-Zubereitung. Um sicherzustellen, dass das Matrixgel während der Handhabung nicht aushärtet, ist es wichtig, die Pipettenspitze zu kühlen, indem Sie das Matrixgel 3-4 Mal pipettieren, bevor Sie es in ein neues Röhrchen übertragen.
- Geben Sie 80 μl des Matrixgel-Zell-Gemischs pro Vertiefung einer 24-Well-Platte hinzu. Es wird empfohlen, einen Tropfen auf die untere Hälfte der Vertiefungswand zu pipettieren und dabei den direkten Kontakt mit der Poly-HEMA-Beschichtung zu vermeiden. Nachdem Sie das Matrixgel hinzugefügt haben, schwenken Sie die Platte, damit die Matrixgel-Zell-Mischung einen Ring um den Rand der Vertiefung bilden kann.
- Legen Sie die 24-Well-Platte 10 Minuten lang mit der rechten Seite nach oben in einen 37 °C 5 % CO2 -Inkubator, damit das Matrixgel teilweise aushärten kann.
HINWEIS: Beginnen Sie sofort mit dem Erwärmen von Maus-Organoidmedien bei 37 °C, nachdem Sie die 24-Well-Platte in den Inkubator gestellt haben.
- Nach einer 10-minütigen Inkubation die 24-Well-Platte auf den Kopf stellen und weitere 50 Minuten inkubieren, damit das Matrixgel vollständig aushärten kann.
- Geben Sie 350 μl vorgewärmtes Maus-Organoidmedium tropfenweise in die Mitte jeder Vertiefung.
HINWEIS: Um die Integrität des Matrixgels zu erhalten, ist es wichtig, den Matrixgelring beim Hinzufügen von Medien zu vermeiden.
- Nachdem Sie das Medium hinzugefügt haben, stellen Sie die 24-Well-Platte wieder in den 37 °C 5 % CO2 -Inkubator.
>2. Auffüllen von Maus-Organoidmedien — TIMING: 10-15 min pro 24-Well-Platte
HINWEIS: Vorhandene Medien sollten alle 48 Stunden durch neue Medien ersetzt werden. Erwärmen Sie vor jedem Medienwechsel die organoiden Mausmedien. Es ist nicht notwendig, dem Medium, das zum Auffüllen verwendet wird, einen ROCK-Inhibitor zuzusetzen.
- Kippen Sie die 24-Well-Platte in einem Winkel von 45° und entfernen Sie mit einer P1000-Pipette vorsichtig vorhandene Medien aus der Mitte jedes Wells, wobei Sie den Matrix-Gel-Ring vermeiden.
- 350 μl vorgewärmtes Maus-Organoidmedium wie in Schritt 1.9 zugeben. Es wird empfohlen, Organoiden, die länger als 5 Tage kultiviert wurden, ein größeres Medienvolumen (bis zu 1 ml) hinzuzufügen, um eine schnelle Erschöpfung der wichtigsten Nährstoffe und Wachstumsfaktoren zu verhindern.
Tabelle 1: Anweisungen für die Herstellung von Maus-Organoidmedien
|
Bestandteil
| Konzentration
|
| B-27 | 1x (aus 50x Konzentrat verdünnen) |
| GlutaMAX | 1x (aus 100x Konzentrat verdünnen) |
| N-Acetyl-L-Cystein | ca. 1,25 Mio. |
| Normocin | 50 μg/mL |
| Rekombinanter humaner EGF, tierversuchsfrei | 50 ng/ml |
| Rekombinanter menschlicher Noggin | 100 ng/ml |
| R-Spondin 1-konditionierte Medien | 10 % konditionierte Medien |
| Nr. A83-01 | 200 nM |
| DHT | 1 nM |
| Y-27632 Dihydrochlorid (ROCK-Inhibitor) | 10 μM |
| Erweitertes DMEM/F-12 | Basismedien |
| R-Spondin 1-konditioniertes Medium wird wie in Drost et al. beschrieben erzeugt. Nach Zugabe aller Komponenten werden organoide Mausmedien mit einem 0,22-μm-Filter filtriert. Der ROCK-Inhibitor wird nur während der Etablierung der Kultur und der Passage von Organoiden zugesetzt. |
