Proteinlysat-Extraktion: Eine Technik zur Lyse von Organoiden zur Sammlung zellulärer Proteine

Zusammenfassung

Quelle: Crowell, P. D. et al. Bewertung der Differenzierungsfähigkeit von Prostata-Epithelzellen der Maus unter Verwendung von Organoidkulturen. J. Vis. Exp. (2019)

In diesem Video demonstrieren wir die Extraktion von Proteinlysaten aus Prostata-Organoiden, die in einem Basalmembran-Matrixring kultiviert wurden. Die Analyse der extrahierten Proteinfraktionen kann helfen, die Expression von Linienmarkern in den Organoiden zu untersuchen.

Protokoll

>1. Extraktion von Proteinlysat aus Prostata-Organoiden für die Western-Blot-Analyse — TIMING: 2,5-4 H

HINWEIS: Vor dem Sammeln von Organoiden für die Proteinlysatextraktion dispasehaltige Medien vorbereiten und vorwärmen (Tabelle 1).

1. Entfernen Sie das Medium aus jeder Vertiefung, indem Sie die 24-Well-Platte in einem Winkel von 45° kippen und das vorhandene Medium vorsichtig mit einer P1000-Pipette aus der Mitte jeder Vertiefung entfernen, wobei Sie den Matrix-Gelring vermeiden.
2. Um Organoide zu sammeln, strahlen Sie das Matrixgel wiederholt, indem Sie 1 ml dispasehaltiges Medium direkt auf den Matrixgelring pipettieren, bis sich der gesamte Ring gelöst hat, und geben Sie es in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
   HINWEIS: Es ist wichtig, den direkten Kontakt mit den Poly-HEMA-beschichteten Vertiefungen zu vermeiden. Direkter Kontakt kann zu einer Kontamination des gesammelten Materials mit Poly-HEMA führen, was sich negativ auf das Überleben der Zellen auswirken kann.
3. Platzieren Sie das/die 1,5 mL-Mikrozentrifugenröhrchen(n) für 30 min bis 1 h in einen 37 °C 5% CO₂ -Inkubator, um einen vollständigen Aufschluss des Matrixgels durch Dispase zu ermöglichen.
4. Die Organoide werden durch Zentrifugation bei 800 x g für 5 min bei RT pelletiert und der Überstand mit einer Mikropipette entfernt.
5. Geben Sie phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) zum Organoid-Pellet und resuspendieren Sie es durch leichtes Schnippen.
   HINWEIS: Wenn das Organoid-Pellet nicht ausreichend resuspendiert wird, kann dies zur Kontamination des Organoidmaterials mit Restdispase oder Matrixgel führen.
6. Pelletieren Sie die Organoide durch Zentrifugation bei 800 x g für 5 min bei RT und entfernen Sie den Überstand mit einer Mikropipette.
7. Frieren Sie die Organoid-Pellets schnell ein, indem Sie jedes Röhrchen in eine Lösung legen, die Trockeneis und Methanol enthält. Die Tube(n) sind bis zur künftigen Verwendung bei -80 °C zu lagern. Alternativ können Sie das Proteinlysat unmittelbar nach Schritt 1.6 extrahieren.
8. Resuspendieren Sie die Organoid-Pellets in 100 μl Proteinlysepuffer (Tabelle 1) pro 10 μl gepacktem Zellvolumen. Zum Resuspendieren streichen.
   HINWEIS: Wenn die Probe nach dem Schnellgefrieren wieder aufgenommen wird, stellen Sie sicher, dass der Proteinlysepuffer aufgetaut ist, bevor Sie die Proben aus einer Temperatur von -80 °C entnehmen, da der Lysepuffer den Proben sofort zugesetzt werden muss, um eine Phosphatase- und Proteaseaktivität zu verhindern.
9. Inkubieren Sie die Proben mindestens 45 Minuten lang in Proteinlysepuffer auf Eis.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, vor der Inkubation auf Eis zu beschallen, um die Effizienz der Rückgewinnung von Kernproteinen zu erhöhen. Eine Beschallung ist jedoch nicht erforderlich. Wenn keine Ultraschalluntersuchung durchgeführt wird, fahren Sie mit Schritt 1.10 fort.
   1. Tauchen Sie die Röhrchen zum Beschallen in nasses Eis und legen Sie die Spitze des Schalldämpfers vorsichtig auf das Mikrozentrifugenröhrchen. Beschallung für 40 s bei 20 kHz.
10. Fahren Sie mit dem Western Blot gemäß den festgelegten Protokollen fort.

Tabelle 1: Anweisungen für die Zubereitung von Schlüssellösungen

Rezepte
Dispase-haltige Medien	1 mg/ml Dispase + 10 μM ROCK-Inhibitor in fortgeschrittenem DMEM F12. Filter mit 0,22 μm Filter sterilisieren.
Dissoziationsmedien	10% FBS + 1x Penicillin-Streptomycin in RPMI 1640. Filter mit 0,22 μm Filter sterilisieren.
Puffer für die Proteinlyse	RIPA-Puffer + Phosphatase-Inhibitoren + Protease-Inhibitoren
Blockierende Lösung	10 % FBS in PBS mit 0,2 % Triton X-100

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Nr. A83-01	Tocris	Nr. 2939
Erweitertes DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12634010
B-27 Supplement (50x), Serum frei	Thermo Fisher Scientific	17504044
Dispase II, Pulver	Thermo Fisher Scientific	Tel.: 17-105-041
Fötales Rinderserum (FBS)	Sigma	Nr. F8667
GlutaMAX Thermo	Fisher Scientific	35050061
Halt Phosphatase-Hemmer	Thermo Fisher Scientific	Artikel-Nr.: 78428
Matrigel GFR-Membran-Matrix	Corning CB-	Nr. 40230C
N-Acetyl-L-Cystein	Sigma	Nr. A9165
Normocin	Thermo Fisher Scientific	ant-nr-1
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ mL)	Thermo Fisher Scientific	Tel.: 15-140-122
Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) (Poly-HEMA)	Sigma	Nr. P3932-25G
Radioimmunpräzipitationsassay (RIPA)	Thermo Fisher Scientific	PI89901
Rekombinanter humaner EGF, tierversuchsfrei	PeproTech	AF-100-15
Rekombinanter menschlicher Noggin	PeproTech	120-10C
RPMI 1640 Medium, HEPES (cs of 10)	Thermo Fisher Scientific	22400105
Schall-Dismembrator	Thermo Fisher Scientific	FB120
Triton X-100	Sigma	X100-5ML
Y-27632 Dihydrochlorid (ROCK-Inhibitor)	Selleck Chemical	Nr. S1049-50MG