Immunfluoreszenz-Bildgebung für ganze Mounts: Eine Fixier- und Färbetechnik zur Bewertung intakter Organoide

>1. Fixierung und Färbung von Prostata-Organoiden für die immunhistochemische Analyse durch konfokale Ganzmontagemikroskopie

1. Sammeln von Prostata-Organoiden von 24-Well-Platten – TIMING: 45-60 min
   HINWEIS: Bei der Entnahme von Prostata-Organoiden für die konfokale Mikroskopie ist es wichtig, sie vorsichtig zu behandeln, um ihre Struktur zu erhalten. Das folgende Entnahmeprotokoll wurde entwickelt, um die Störung der Organoidstruktur während der Isolierung zu reduzieren.
   1. Entfernen Sie das Medium aus jeder Vertiefung der Platte, die Organoide enthält, indem Sie die Platte in einem Winkel von 45° kippen.
   2. Verdauen Sie das Matrixgel, indem Sie es mit 500 μl dispasehaltigem Medium (Tabelle 1) für 30 min in einem 37 °C 5% CO₂ -Inkubator inkubieren.
   3. Die aufgeschlossene Organoidsuspension wird in einem Mikrozentrifugenröhrchen aufgefangen und die Organoide durch Zentrifugation bei 800 x g für 3 min bei RT pelletiert. Den Überstand entfernen.
2. Immunfluoreszenzfärbung von Prostata-Organoiden – TIMING: 3-4 Tage (1-5 h/Tag)
   1. 500 μl 4%iges Paraformaldehyd in PBS zugeben und 2 h bei RT unter leichtem Schütteln inkubieren.
   2. Die Organoide werden durch Zentrifugation bei 800 x g für 3 min bei RT pelletiert, der Überstand entfernt und das Pellet 15 min lang mit 1 mL PBS unter leichtem Schütteln gewaschen.
   3. Waschen Sie das Pellet wie in Schritt 1.2.2 weitere zwei Mal.
   4. Die Organoide werden durch Zentrifugation bei 800 x g für 3 min bei RT pelletiert und der Überstand entfernt. Geben Sie 1 μg/ml DAPI in eine Blockierungslösung (Tabelle 1). 2 h bei RT oder alternativ über Nacht bei 4 °C unter leichtem Schütteln inkubieren.
   5. Die Organoide werden durch Zentrifugation bei 800 x g für 3 min bei RT pelletiert und der Überstand entfernt. Primärantikörper (Kaninchen-Anti-p63, Maus-Anti-Zytokeratin 8) in Blockierungslösung geben und über Nacht bei 4 °C unter leichtem Schütteln inkubieren.
   6. Die Organoide werden durch Zentrifugation bei 800 x g für 3 min bei RT pelletiert und der Überstand entfernt. Waschen Sie das Pellet 15 Minuten lang mit 1 mL PBS unter leichtem Schütteln.
   7. Waschen Sie das Pellet wie in Schritt 1.2.6 weitere zwei Mal.
   8. Die Organoide werden durch Zentrifugation bei 800 x g für 3 min bei RT pelletiert und der Überstand entfernt. Sekundärantikörper (Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Alexa Fluor 594, Ziegen-Anti-Maus-IgG-Alexa Fluor 488) in Blockierungslösung geben und über Nacht bei 4 °C unter leichtem Schütteln inkubieren.
   9. Die Organoide werden durch Zentrifugation bei 800 x g für 3 min bei RT pelletiert, der Überstand entfernt und das Pellet 15 min lang mit 1 mL PBS unter leichtem Schütteln gewaschen.
   10. Waschen Sie das Pellet wie in Schritt 1.2.9 weitere zwei Mal.

>2. Tissue Clearing und Mounting der gefärbten Prostata-Organoide für die konfokale Whole-Mount-Mikroskopie — TIMING: 7 h

1. Die Organoide werden durch Zentrifugation bei 800 x g für 3 min bei RT pelletiert und der Überstand entfernt.
2. 1 ml 30 % Saccharose in PBS mit 1 % Triton X-100 zugeben und 2 h bei RT unter leichtem Schütteln inkubieren.
3. Die Organoide werden durch Zentrifugation bei 800 x g für 3 min bei RT pelletiert und der Überstand entfernt.
4. 1 ml 45 % Saccharose in PBS mit 1 % Triton X-100 zugeben und 2 h bei RT unter leichtem Schütteln inkubieren.
5. Die Organoide werden durch Zentrifugation bei 800 x g für 3 min bei RT pelletiert und der Überstand entfernt.
6. 1 ml 60 % Saccharose in PBS mit 1 % Triton X-100 zugeben und 2 h bei RT unter leichtem Schütteln inkubieren.
7. Die Organoide werden durch Zentrifugation bei 800 x g für 3 min bei RT pelletiert und 95% des Überstands entfernt.
   HINWEIS: Das Pellet wird lockerer, wenn die Konzentration an Saccharose steigt. Es wird empfohlen, die DAPI-gefärbten Organoide unter dem UV-Licht zu beobachten, um sicherzustellen, dass sie bei der Entfernung des Überstands nicht verloren gegangen sind.
8. Übertragen Sie einen 10-20 μl Tröpfchen der restlichen Suspension auf ein kammerförmiges Deckglas und fahren Sie mit der konfokalen Mikroskopie fort.
   HINWEIS: Deckglasfragmente können auf beiden Seiten des Tröpfchens platziert werden, um als Abstandshalter verwendet zu werden (Abbildung 1C). Diese verhindern, dass Organoide kollabieren, wenn ein Deckglas über das Tröpfchen gelegt wird.

Tabelle 1: Anweisungen für die Zubereitung von Schlüssellösungen

Abbildung 1: Analyse der Expression von Lineage-Markern in Prostata-Organoiden mittels Western Blot und konfokaler Whole-Mount-Mikroskopie.(A) Repräsentative Phasenkontrastbilder von basalen (oben) und luminalen (unten) Organoiden nach 7 Tagen Kultur. Maßstabsbalken = 100 μm. (B) Western-Blot-Analyse von basalen (Bas) und luminalen (Lum) Organoiden nach 5 Tagen Kultur. Färbung des basalen Markers Cytokeratin 5 (K5) und des luminalen Markers Cytokeratin 8 (K8) sowie einer Belastungskontrolle des Histons H3 (HH3). (C) Schematische Darstellung eines gekammerten Deckglases mit Abstandshaltern. (D) Repräsentative differentielle Interferenzkontrast- (DIC) und Immunfluoreszenzbilder von basalen (oben) und luminalen (unten) Organoiden nach 7-tägiger Kultur. Färbung für p63 (rot), K8 (grün) und DAPI (blau) einzeln und zusammengeführt. Maßstabsleisten = 100 μm.