Funktionalisierte drahtbasierte Zielzellisolierung: Eine ex vivo Technik zur Isolierung von Krebszellen aus gespicktem peripherem Blut

HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von HT-29-Zellen (humane Dickdarmkrebs-Zelllinie) aus PBS oder aus künstlichen Mischungen von HT-29-Zellen und peripherem Blut. Das gleiche Experiment wurde mit zwei weiteren Zelllinien (LNCaP und VCaP) durchgeführt und kann theoretisch mit allen Zellen durchgeführt werden, die EpCAM exprimieren.

>1. Vorbereitung der Zielzellen

1. Zellkultur und Markierung von Zellen
   Anmerkung: Bei diesem Protokoll werden die Zellen in 75 cm² großen Kulturflaschen kultiviert. Bitte passen Sie die Mengen an Reagenzien entsprechend an, wenn andere Zellkulturgeräte verwendet werden (z.B. 25 cm² Kulturschalen, 6-Well-Platten, etc.). Alle verwendeten Flüssigkeiten werden in einem Wasserbad auf 37 °C vorgewärmt. Wenn nicht anders angegeben, werden alle Protokollschritte bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt.
   1. Kultivieren Sie HT-29-Zellen in McCoy's 5a modifiziertem Medium, ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 20 mM Hepes, 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin bei 37 °C in einer 5 % CO₂ -Atmosphäre.
   2. Wenn die Zellen zu 90 % konfluent sind, entfernen Sie das Medium und spülen Sie die Zellen mit 10 ml 1x PBS.
   3. Um Zellen zu ernten, geben Sie 2 ml der Zellablösungslösung (Tabelle der Materialien und Reagenzien) zu den Zellen und inkubieren Sie die Zellen für ca. 5 min bei 37 °C.
      Anmerkung: Die Ablöselösung enthält proteolytische und kollagenolytische Enzyme in 1x PBS, 0,5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 3 mg/L Phenolrot. Reduzieren Sie die Vorwärmzeit der Zellablöselösung auf ein Minimum, da diese nach 1 h bei 37 °C inaktiv ist. Decken Sie die gesamte Zellschicht ab, um eine optimale Zellablösung zu erhalten.
   4. Kontrollieren Sie die Ablösung der Zellen mit einem inversen Mikroskop.
   5. Alle abgelösten Zellen werden in ein 50-ml-Röhrchen überführt, das mit 10 ml Zellkulturmedium vorgefüllt ist (wie in Schritt 1.1.1 verwendet), und die Zellen durch Pipettieren resuspendiert.
   6. Legen Sie die restliche Zellensuspension auf einen horizontalen Rollenmischer bei RT und fahren Sie mit dem Etikettierschritt fort.
2. Markierung von Zielzellen in lebenden Zellen
   1. 1 μl 5 mM CFSE (geliefert in Dimethylsulfoxid, DMSO) in 1 mL 1x PBS verdünnen, auf 37 °C vorgewärmt, um die gebrauchsfertige 5 μM CFSE-Markierungslösung zu erhalten.
      Anmerkung: Für ein optimales Färbeergebnis verwenden Sie frisch zubereitete Lösungen.
   2. Bereiten Sie eine gebrauchsfertige DNA-Färbelösung (Tabelle der Materialien und Reagenzien) in 1x PBS vor und lagern Sie diese bei 2-6 °C lichtgeschützt.
      Anmerkung: Für ein optimales Färbeergebnis verwenden Sie frisch zubereitete Lösungen.
   3. Nehmen Sie die Zellen aus dem horizontalen Rollenmischer (Schritt 1.1.6.) und pelletieren Sie die Zellen bei 300 x g für 10 min. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 10 mL 1x PBS.
   4. Spülen Sie die Zellen erneut mit 1x PBS und resuspendieren Sie das Zellpellet in einer gebrauchsfertigen 500 μL CFSE-Markierungslösung.
   5. Inkubieren Sie die Zellen 15 min lang bei 37 °C und sammeln Sie die Zellen nach der Zentrifugation bei 300 x g für 3 min.
   6. Resuspendieren Sie die markierten Zellen in 1 mL vorgewärmtem Zellkulturmedium und lassen Sie die Zellen 30 Minuten lang bei 37 °C regenerieren.
   7. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 x g für 3 min und resuspendieren Sie die Zellpellets in 1 mL gebrauchsfertiger DNA-Färbelösung bei 37 °C für 10 min.
   8. Pelletieren Sie die Zellen, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 4 mL 1x PBS. Bestimmen Sie die Zelldichte mit einem Hämozytometer und überprüfen Sie die Fluoreszenzmarkierung mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) und Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-Filtern ausgestattet ist (Abbildung 1A und 1E).
   9. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 3 min und resuspendieren Sie das Zellpellet entsprechend den für das jeweilige Experiment benötigten Zelldichten, wie im nächsten Abschnitt angegeben, und legen Sie es auf Eis.

>2. Aufladen des Drahtes

HINWEIS: Zellen können aus Zielzellen-/peripheren Blutspitzen im Millilitermaßstab oder durch Bereitstellung einer geringen Anzahl von Zellen im Mikrolitermaßstab isoliert werden. Während der erste Ansatz die Nachahmung seltener Zellbedingungen im peripheren Blut ermöglicht, kann der zweite Ansatz die bevorzugte Methode sein, um einige Zellen zum Zwecke der Protokolloptimierung/-prüfung zu befestigen.

1. Aufladen des Drahtes mit einer großen Menge an Zellsuspensionen
   1. Bereiten Sie eine 2%ige BSA-Blockierungslösung vor, indem Sie 0,8 g BSA in 40 ml 1x PBS auflösen (Verwendung in Zellkulturen). BSA durch anfängliches Vortexen und anschließende Inkubation bei RT auf einem horizontalen Walzenmischer für 10-20 min auflösen.
   2. Spülen Sie leere EDTA-Röhrchen/Natriumheparinröhrchen mit 2 ml 2 % BSA aus, um Antikoagulanzienrückstände zu entfernen, und entsorgen Sie die Lösung. Die Oberfläche des Röhrchens wird durch Inkubation bei RT mit 5 mL 2 % BSA auf einem horizontalen Walzenmischer bei 15 U/min für 30 Minuten blockiert und die Lösung verworfen.
   3. Die markierten Zellen (Abschnitt 1.2.) werden auf eine Dichte von 100.000 Zellen/ml verdünnt und der Draht mit 5 ml aufgeladen.
   4. Geben Sie 5 ml der markierten Zellsuspension (insgesamt 500.000 Zellen) in das Röhrchen. Vermeiden Sie Blasen bei der Zugabe der Zellsuspension.
   5. Entfernen Sie den Draht aus dem Ablagefach sowie die Gummikappe, mit der der Draht befestigt ist, und spülen Sie ihn mit 1x PBS ab (Abbildung 2).
   6. Mit Hilfe einer Spritzennadel (20 G) in die Gummischlauchkappe des EDTA-Schlauches (Schritt 2.1.4.) eindringen und den Draht so einführen, dass das Funktionsteil vollständig in die Küvettensuspension eingetaucht ist, wenn die Kappe wieder auf dem Schlauch sitzt und der Schlauch auf den gekippten Rollenmischer aufgesetzt wird.
      Anmerkung: Der dreifach spiralförmige Funktionsteil des Drahtes sollte während des gesamten Ladevorgangs mit einer Zellaufhängung bedeckt sein.
   7. Drehen Sie die Rohre auf einem gekippten Rollenmischer 30 Minuten lang bei 5 U/min, damit die Zellen am Draht befestigt werden können.
   8. Spülen Sie den Draht mit 5 mL 1x PBS und lagern Sie ihn im Dunkeln bei 2-6 °C in einem 15 mL Röhrchen mit 1x PBS bis zur visuellen Untersuchung.
      Anmerkung: Der Funktionsteil des Drahtes muss immer in PBS getaucht werden, um die Zellen nicht zu beschädigen.
2. Isolierung von Zielzellen aus künstlichen Mischungen mit peripherem Blut (alternative Auflademethode zu: 2.1. Aufladen des Drahtes mit einer großen Menge an Zellsuspensionen)
   1. Markierte Zellen werden verdünnt (Abschnitt 1.2.), um Zellsuspensionen mit hoher Zelldichte (> 1.000.000 Zellen/ml) zu erhalten, wodurch das Volumen der Zellsuspension, die dem peripheren Blut zugesetzt wird, gering gehalten wird.
   2. Geben Sie 500 bis 500.000 Zellen zu 5 ml peripherem Blut und mischen Sie sie, indem Sie das Röhrchen umdrehen.
   3. Nehmen Sie den Draht aus dem Aufbewahrungsfach, entfernen Sie die Gummikappe, mit der der Draht befestigt ist, und spülen Sie ihn mit 1x PBS ab.
   4. Einen neuen Röhrchendeckel mit dem nicht funktionsfähigen Teil des Gerätes mit einer Spritzennadel (20 G) so durchdringen, dass der Funktionsteil vollständig in das mit Stacheln gefüllte Blut eingetaucht ist, wenn die Kappe wieder auf das Röhrchen gesetzt und der Schlauch auf den gekippten Rollenmischer gelegt wird.
      Anmerkung: Der dreifach spiralförmige Funktionsteil des Drahtes sollte während des gesamten Ladevorgangs mit einer Zellaufhängung bedeckt sein.
   5. Inkubieren Sie das Rohr auf dem gekippten Walzenmischer bei 5 U/min für 30 min bei RT.
   6. Spülen Sie den Draht dreimal in 1x PBS und lagern Sie ihn im Dunkeln in einem 15-ml-Röhrchen mit 1x PBS bis zur visuellen Untersuchung.
      Anmerkung: Der Funktionsteil des Drahtes muss immer untergetaucht werden, um die Zellen nicht zu beschädigen.
3. Aufladen des Drahtes aus Zellsuspensionen mit geringem Volumen (alternative Lademethode zu: 2.1. Aufladen des Drahtes mit einer großen Menge an Zellsuspensionen)
   1. Resuspendieren Sie die markierten Zellen bei 1.000.000 Zellen/ml in 1x PBS.
   2. Befestigen Sie eine 150 mm Einweg-Pasteurpipette aus Glas waagerecht auf einem Gestell.
   3. Entfernen Sie den Draht aus dem Ablagefach, aber lassen Sie die gelbe Gummikappe, die den Draht hält.
   4. Legen Sie den Draht so in die Pipette, dass sich der funktionalisierte Teil in der Spitze der Pasteurpipette befindet und das Glas nicht berührt.
      Anmerkung: Die Spitze des Drahtes sollte nicht aus der Pasteur-Pipettenspitze herausragen. Vermeiden Sie es, das hintere Ende der Pasteur-Pipettenspitze mit der Gummikappe zu stecken, die den Draht hält. Wenn sie fest angebracht sind, können Zellsuspensionen nicht von der anderen Seite in die Pipettenspitze geladen werden.
   5. Laden Sie 15 μl der Zellsuspension in die Spitze der Pasteurpipette, die den funktionalisierten Teil des Drahtes bedeckt.
   6. Inkubieren Sie den Draht 10 Minuten lang. Drehen Sie den zusammengebauten Draht/die Pasteur-Pipettenspitze jede Minute manuell viertel.
   7. Entfernen Sie den Draht von der Pasteur-Pipettenspitze, spülen Sie ihn in 5 mL 1x PBS und lagern Sie ihn dunkel bei 2-6 °C in einem 15 mL Röhrchen mit 1x PBS bis zur visuellen Untersuchung.
      Anmerkung: Der Funktionsteil muss immer in 1x PBS getaucht werden, um die Zellen nicht zu beschädigen.

>3. Zellen auf dem Draht zählen

HINWEIS: Halten Sie den Funktionsteil des Drahtes immer in 1x PBS getaucht, um eine Beschädigung der Zellen zu vermeiden.

1. Zeichnen Sie mit einem Fettstift eine rechteckige Fläche auf einen Objektträger und fügen Sie 500 μL 1x PBS hinzu.
2. Biegen Sie den nicht funktionsfähigen Teil des Drahtes und legen Sie ihn so auf den Glasschieber, dass der Funktionsteil in 1x PBS eingetaucht wird.
   Anmerkung: Passen Sie den Bereich des Rechtecks und das Volumen von 1x PBS an, um den Funktionsteil des Drahtes vollständig abzudecken. Verwenden Sie ein doppelseitiges Klebeband, um den nicht funktionsfähigen Teil des Drahtes auf der Rutsche zu befestigen.
3. Überprüfen Sie beide Seiten des Drahtes visuell, um die erfassten Zellen aufzulisten (Abbildung 1B und 1F).
   Anmerkung: Die Bestimmung des Vorhandenseins von Zellen erfolgt mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit Filtern für DAPI und FITC ausgestattet ist. Beide Seiten des Drahtes können inspiziert werden und die Anzahl der Zellen kann entweder beurteilt (bei hohen Zellzahlen) oder gezählt werden (nur bei geringer Anzahl von Zellen am Draht möglich). Dieser Schritt kann übersprungen werden, wenn die Aufzählung von Zellen nicht erforderlich ist.
4. Legen Sie den Draht nach dem Scannen wieder in das 15-ml-Röhrchen mit dem 1x PBS und lagern Sie den Draht im Dunkeln.
   Anmerkung: Der größte Teil des nicht funktionierenden Teils des Drahtes kann abgeschnitten (einschließlich der Biegung) und entfernt werden, was die Lagerung erleichtert.

>4. Ablösung und Rückgewinnung von Zielzellen

HINWEIS: Die Ablösung der Zellen muss innerhalb von 4 Stunden nach der Isolierung erfolgen.

1. 4 mg der Freisetzungspufferkomponente (Tabelle der Materialien und Reagenzien) pro ml 1x PBS lösen und die Lösung durch einen 0,2 μm Sterilfilter filtrieren, um den gebrauchsfertigen Puffer zu erhalten.
   Anmerkung: Das Polymer des Drahtes besteht aus einem Hydrogel, das mit Anti-EpCAM-Antikörpern funktionalisiert ist, die eine Bindung an EpCAM-präsentierende Zielzellen ermöglichen. Der Freisetzungspuffer enthält ein proteolytisches Kohlenstoff-Sauerstoff-Enzym, das in der Lage ist, das Hydrogel zu spalten. Die proteolytische Spaltung führt zum Abbau des Polymers und damit zur Ablösung der eingefangenen Zellen.
2. Den Freisetzungspuffer 5 min lang auf 37 °C vorwärmen.
3. Fügen Sie 1,6 mL Freisetzungspuffer hinzu, um ein 1,5 mL Reaktionsröhrchen zu füllen.
   Anmerkung: Röhrchen, die für ein Reaktionsvolumen von 1,5 mL ausgelegt sind, ermöglichen die Anwendung von 1,6 mL, die zum Eintauchen des Funktionsteils des Drahtes erforderlich ist.
4. Inkubieren Sie den Funktionsteil des Drahtes 20 Minuten lang im Freisetzungspuffer bei 37 °C (Wasserbad). Verwenden Sie die mit dem Draht gelieferte Gummikappe anstelle der Röhrchenkappe, um den Draht im 1,5-ml-Röhrchen zu fixieren, um eine Kontamination während der Inkubation im Wasserbad zu vermeiden.
5. Übertragen Sie die Draht-Rohr-Einheit für 15 Min. bei RT und 500 U/min auf einen Schüttler< /> Anmerkung: Der Shaker hat eine Umlaufbahn von 1,5 mm.
6. Legen Sie die Draht-Rohr-Einheit in eine Zentrifuge und schleudern Sie sie 10 Minuten lang bei 300 x g.
7. Entfernen Sie den Draht aus dem Röhrchen, schließen Sie die Kappe und zentrifugieren Sie das Röhrchen erneut bei 300 x g für 10 min.
   Anmerkung: Der Draht kann in 1x PBS bei 2-6 °C im Dunkeln gelagert werden, um die Zellzählung zu ermöglichen, um die Ablösungseffizienz zu beurteilen / zu prüfen, ob Zellen auf dem Draht verbleiben.
8. Um das Volumen der Zellsuspension zu reduzieren, entfernen Sie alle bis auf 100 μl (Mikromanipulation) oder alternativ 300 μl (Zytozentrifugation und anschließende Lasermikrodissektion) des Überstands und fahren Sie sofort mit der Einzelzellprobenahme fort.

Abbildung 1: Visualisieren von beschrifteten Zellen.(A,E) Zellen vor dem Aufladen: Die Zellen werden mit CFSE markiert und mit einem DNA-Interkalationsfarbstoff gegengefärbt, der einen Bereich der CFSE-Signalintensität (grün) anzeigt. (B,F) Markierte Zellen, die auf dem Draht eingefangen wurden. (C,G) Draht nach dem Zellablösungsverfahren. (D,H) Zellen, die vom Draht gelöst und durch Zytozentrifugation auf einen Objektträger zurückgewonnen werden. CFSE: FITC-Kanal (grün). DNA-Färbung: DAPI-Kanal (blau).

Abbildung 2: Abbildung 2: Draht und Ablagefach.(A) Fächer des Drahtes. (B) Detail des funktionalisierten Teils.