Einzelzellprobenahme mittels Mikromanipulation: Eine Technik zur Isolierung einzelner Zellen aus Krebszellsuspension

>1. Einzelzell-Probenahme

1. Mikromanipulation
   HINWEIS: Um nachgelagerte Anwendungen wie die Gesamtgenomanalyse (WGA) zu ermöglichen, werden isolierte Einzelzellen zu 2 μl Zelllyse-Mastermix hinzugefügt. Bereiten Sie einen Mastermix entsprechend der Anzahl der zu verarbeitenden Zellen vor. Berechnen Sie zusätzliche Volumina für Verluste durch Pipettieren und legen Sie den Zelllyse-Mastermix auf Eis.
   1. Bereiten Sie den Zelllyse-Mastermix vor (Bestandteile des WGA-Kits, Tabelle der Materialien und Reagenzien). Kurz gesagt, mischen Sie 2,0 μl Reaktionspuffer, 1,3 μl Octylphenoxypolyethoxyethanol (10%ige Lösung), 1,3 μl 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)-phenyl-polyethylenglykol (10%ige Lösung), 2,6 μl einer Proteinase-K-Lösung und 12,8 μl RNase/DNase-freies Wasser, um einen Mastermix für 10 Proben (Gesamtvolumen 20 μl) zu erhalten.
      Anmerkung: Für mehr Proben erhöhen Sie die Volumina entsprechend.      
   2. Zeichnen Sie mit einem Fettstift einen Bereich, der die Zellsuspension an Ort und Stelle hält. Passen Sie Fläche und Volumen an, wenn die Zelldichte zu hoch ist (d.h. markieren Sie eine größere Fläche auf dem Objektträger, laden Sie 1x PBS und ein Aliquot der Zellsuspension).
   3. Pipettieren Sie die gesamte Suspension der Zielzelle auf den Objektträger.
   4. Übertragen Sie den Objektträger in ein Mikroskop, das mit einem Mikromanipulator ausgestattet ist. Lassen Sie die Zellen 5 Minuten ruhen.
   5. Bereiten Sie 0,2 mL PCR-Röhrchen vor, die mit 2,0 μl Zelllyse-Mastermix (hergestellt in Schritt 1.1.1.) beladen sind, und lagern Sie es auf Eis.
   6. Sammeln Sie einzelne Zellen in 1 μl 1x PBS mit dem Mikromanipulator und überführen Sie die Zellen in ein Röhrchen mit dem Zelllyse-Mastermix.
      Anmerkung: Um mikromanipulierte Zellen in den Zelllysepuffer zu übertragen, legen Sie die Kapillare direkt in die 2 μl der Lyselösung und stoßen Sie sie aus, bis Blasen zu sehen sind.
   7. Die Probe wird mit einer Desktop-Mikrofuge kurz bei 2000 x g für 3 s heruntergeschleudert, um die gesamte Flüssigkeit am Boden des Röhrchens aufzufangen. Legen Sie die Proben auf Eis.