Einzelzellprobenahme mittels Mikromanipulation: Eine Technik zur Isolierung einzelner Zellen aus Krebszellsuspension

Zusammenfassung

Quelle: Chen S. et al. Zielzell-Voranreicherung und Ganzgenom-Amplifikation für die Downstream-Charakterisierung einzelner Zellen. J. Vis. (2018)

Dieses Video beschreibt die Technik zur Isolierung einzelner Zellen aus einem Pool von Zielzellen, um eine nachgelagerte Analyse durchzuführen. Bei dieser Methode wird ein Mikromanipulator, der an einem Mikroskop angebracht ist, zur hochpräzisen Isolierung einer einzelnen Zielzelle verwendet.

Protokoll

>1. Einzelzell-Probenahme

1. Mikromanipulation
   HINWEIS: Um nachgelagerte Anwendungen wie die Gesamtgenomanalyse (WGA) zu ermöglichen, werden isolierte Einzelzellen zu 2 μl Zelllyse-Mastermix hinzugefügt. Bereiten Sie einen Mastermix entsprechend der Anzahl der zu verarbeitenden Zellen vor. Berechnen Sie zusätzliche Volumina für Verluste durch Pipettieren und legen Sie den Zelllyse-Mastermix auf Eis.
   1. Bereiten Sie den Zelllyse-Mastermix vor (Bestandteile des WGA-Kits, Tabelle der Materialien und Reagenzien). Kurz gesagt, mischen Sie 2,0 μl Reaktionspuffer, 1,3 μl Octylphenoxypolyethoxyethanol (10%ige Lösung), 1,3 μl 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)-phenyl-polyethylenglykol (10%ige Lösung), 2,6 μl einer Proteinase-K-Lösung und 12,8 μl RNase/DNase-freies Wasser, um einen Mastermix für 10 Proben (Gesamtvolumen 20 μl) zu erhalten.
      Anmerkung: Für mehr Proben erhöhen Sie die Volumina entsprechend.      
   2. Zeichnen Sie mit einem Fettstift einen Bereich, der die Zellsuspension an Ort und Stelle hält. Passen Sie Fläche und Volumen an, wenn die Zelldichte zu hoch ist (d.h. markieren Sie eine größere Fläche auf dem Objektträger, laden Sie 1x PBS und ein Aliquot der Zellsuspension).
   3. Pipettieren Sie die gesamte Suspension der Zielzelle auf den Objektträger.
   4. Übertragen Sie den Objektträger in ein Mikroskop, das mit einem Mikromanipulator ausgestattet ist. Lassen Sie die Zellen 5 Minuten ruhen.
   5. Bereiten Sie 0,2 mL PCR-Röhrchen vor, die mit 2,0 μl Zelllyse-Mastermix (hergestellt in Schritt 1.1.1.) beladen sind, und lagern Sie es auf Eis.
   6. Sammeln Sie einzelne Zellen in 1 μl 1x PBS mit dem Mikromanipulator und überführen Sie die Zellen in ein Röhrchen mit dem Zelllyse-Mastermix.
      Anmerkung: Um mikromanipulierte Zellen in den Zelllysepuffer zu übertragen, legen Sie die Kapillare direkt in die 2 μl der Lyselösung und stoßen Sie sie aus, bis Blasen zu sehen sind.
   7. Die Probe wird mit einer Desktop-Mikrofuge kurz bei 2000 x g für 3 s heruntergeschleudert, um die gesamte Flüssigkeit am Boden des Röhrchens aufzufangen. Legen Sie die Proben auf Eis.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1x PBS)	Thermo Fisher Scientific	Tel.: 10010-015
Vacutainer-EDTA- (oder Na-Heparin-) Röhrchen	Bd	366450 (oder 366480)	Wird als Reaktionsgefäß für die ex vivo-Erfassung von Zielzellen verwendet
Pasteurpipetten 150 mm	Volac	Nr. D810	Wird für die Anwendung von Zellen mit geringem Volumen auf den C&R
Fett-Stift	Dako	Nr. 2002	Wird auf Objektträgern verwendet, um die Zellsuspension an Ort und Stelle zu halten
Axiovert M200 ausgestattet mit Mikromanipulator MMJ und CellTram vario	Zeiss/Eppendorf		Verwenden Sie Mikromanipulation zur Hand
Mikrokapillaren (25 μm Durchmesser), CustomTip Typ I	Eppendorf	930001201	Wird zur Mikromanipulation von Zellen verwendet
0,2 mL PCR-Röhrchen	Biozym	Artikel-Nr.: 710920

verwendet