Einzelzellprobenahme mittels Laser-Capture-Mikrodissektion: Eine Technik zur Gewinnung von Zielzellen aus einer heterogenen Zellpopulation

Zusammenfassung

Quelle: Chen S. et al. Zielzell-Voranreicherung und Ganzgenom-Amplifikation für die Downstream-Charakterisierung einzelner Zellen. J. Vis. (2018)

Dieses Video beschreibt die Technik zur Gewinnung einer einzelnen Zelle aus einer heterogenen Zellpopulation mittels Laser-Capture-Mikrodissektion. Die einzelne isolierte Zelle kann für weitere genomische Studien oder die Krebsforschung verwendet werden.

Protokoll

>1. Einzelzell-Probenahme

1. Laser-Mikrodissektion
   HINWEIS: Einzelne Zellen werden zu 4,5 μl Zelllyse-Mastermix (Bestandteile des WGA-Kits, Tabelle der Materialien und Reagenzien) für WGA hinzugefügt.
   1. Bereiten Sie den Zelllyse-Mastermix nach Czyż et al. vor, indem Sie 5,0 μl Reaktionspuffer, 1,3 μl Octylphenoxypolyethoxyethanol (10%ige Lösung), 1,3 μl 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylenglykol (10%ige Lösung) bzw. 2,6 μl einer Proteinase-K-Lösung und 34,8 μl RNase/DNase-freies Wasser mischen, um einen Mastermix für 10 Proben (Gesamtvolumen 45 μl) zu erhalten. Lege den Mastermix auf ice.
      Anmerkung: Für mehr Proben erhöhen Sie die Volumina entsprechend.
   2. Behandeln Sie die membranbeschichteten Objektträger mit UV-Beschichtung, die für die Lasermikrodissektion geeignet sind. Legen Sie die Objektträger in ein DNA-Vernetzergerät und belichten Sie sie für ca. 10 min der höchsten UV-Strahlung
   .
   3. Den membranbeschichteten Objektträger in eine Zytozentrifuge einbauen und die gesamte Zellsuspension bei 300 x g für 5 min.
      cytospinnieren Anmerkung: Bei Verwendung eines In-Liquid-Systems, bei dem die Zellen auf den Objektträger in Lösung zytozentrifugiert werden, entfernen Sie den Überstand nach der Zytozentrifugation und wenden Sie einen Dry-Spin bei 1140 x g für 1 min an.
   4. Fahren Sie direkt mit der Lasermikrodissektion fort oder lassen Sie die Cytospins über Nacht an der Luft trocknen und frieren Sie die Proben für die Langzeitlagerung bei -20 °C ein.
   5. Pipettieren Sie 4,5 μl des Zelllyse-Mastermixes in den Deckel eines 0,2 mL PCR-Röhrchens und entnehmen Sie einzelne Zellen mittels Lasermikrodissektion.
   6. Nehmen Sie das PCR-Röhrchen aus dem Laser-Mikrodissektionsmikroskop und verschließen Sie das Röhrchen. Sammeln Sie die gesamte Flüssigkeit am Boden des Röhrchens durch kurzes Schleudern und legen Sie die Probe auf Eis.
   7. Fahren Sie mit einer einzelligen WGA fort oder lagern Sie die isolierten Proben bis zu 1 Monat lang bei -80 °C, bevor Sie sie weiterverarbeiten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
McCoy's 5A Medium (1x) Suppl. mit L-Glutamin	Thermo Fisher Scientific	Tel.: 16600-082	Kulturmedium für HT-29-Zellen, Anpassung des Kulturmediums an die für die Experimente verwendete Zelllinie
HEPES-Pufferlösung (1 m)	PAA	Nr. S11-001	Ergänzung für McCoy's 5A Medium
Fötales Rinderserum Gold	PAA	Nr. A15-151	Nachtrag für McCoy's 5a Modified Medium
Penicillin-Streptomycin (100x)	Biowest (Biowesten)	Nr. L0018-100	Nachtrag für McCoy's 5a Modified Medium
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1x PBS)	Thermo Fisher Scientific	Tel.: 10010-015
Accutase	Biowest (Biowesten)	Nr. L0950-100	Lösung zur Zellablösung (Zellkultur)
Wasserbad	DaF	Typ 1003	Wird zum Vorwärmen von Lösungen verwendet
Brutkasten	Thermo Fisher Scientific		Wird zur Inkubation von Zellen (Zellkultur) verwendet
50 mL Reaktionsgefäße	VWR	Artikel-Nr.: 525-0403
Walzenmischer	Stuart Wissenschaftlich	SRT6D	Wird verwendet, um Zellen am Draht zu befestigen und gleichzeitig zu verhindern, dass die Zellen sedimentieren
CellTrace CFSE-Kit zur Zellproliferation	Thermo Fisher Scientific	Nr. C34554	Wird verwendet, um lebende Zellen zu markieren (zytoplasmatische Markierung)
Hoechst 33342	Nr. H3570	Thermo Fisher Scientific	Wird zum Färben von DNA (Nuklein-Gegenfärbung)
Zentrifuge (ausgestattet für 15 mL und 50 mL Reaktionsgefäße)	Thermo Fisher Scientific	Heraeus Megafuge 40R	Wird für die Pelletierung von Zellen verwendet
Observer Z1 (Fluoreszenz-/Laser-Mikrodissektionsmikroskop)	Carl Zeiss Mikrobildgebung		Inverses Mikroskop (Immunfluoreszenz), das Lasermikrodissektion durchführen kann; Fluoreszenzmikroskope müssen in der Lage sein, Hoechst 33342 (DAPI-Filter) und CFSE (FITC-Filter) zu detektieren
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503-50G	Wird zur Beschichtung von Glas-/Kunststoffoberflächen verwendet
MS1 Mini-Shaker	Sigma-Aldrich	Z404039	Wird zum Vortexen verwendet
Detektor CANCER03 DC03	Gilupi	GIL003	Funktionalisierter Draht, der in der Lage ist, EpCAMpositive Zellen zu isolieren und zu lösen (auch als Catch&Release, C&R bezeichnet)
Spritzennadeln (G20)	VWR	Tel.: 613-0554	Wird verwendet, um Gummikappen zu durchstechen, damit der nicht funktionsfähige Teil des C&R hindurchführen kann
Neubauer-Kammer	Roth	Nr. T729.1	Wird verwendet, um Zellen zu zählen
Pasteurpipetten 150 mm	Volac	Nr. D810	Wird für die Anwendung von Zellen mit geringem Volumen auf den C&R
Fett-Stift	Dako	Nr. 2002	Wird auf Objektträgern verwendet, um die Zellsuspension an Ort und Stelle zu halten
Delfia PlateShaker	Perkin Elmer	Tel.: 1296-003	Wird zum Rühren während der Zellablösung verwendet
1,5 mL Röhrchen	Eppendorf	30.125.150
Ampli1 WGA-Bausatz	Silizium-Biosysteme		Zu bestellen über Silicon Biosystems
0,2 mL PCR-Röhrchen	Biozym	Artikel-Nr.: 710920
Zytozentrifuge und Ausrüstung	Hettich	Universell 32	Verwenden Sie die Zytozentrifuge zur Hand
Thermocycler	Bio-Rad	DNA-Engine-Dyade	Jeder Thermocycler mit beheiztem Deckel kann verwendet werden
Mikrozentrifuge	Roth	CX73.1	Verwenden Sie eine Tischzentrifuge zur Hand
UV-Stratalinker 1800	Stratagene	400072	Verwenden Sie den DNA-Vernetzer zur Hand

verwendet verwendet