Einzelzellprobenahme mittels Laser-Capture-Mikrodissektion: Eine Technik zur Gewinnung von Zielzellen aus einer heterogenen Zellpopulation

>1. Einzelzell-Probenahme

1. Laser-Mikrodissektion
   HINWEIS: Einzelne Zellen werden zu 4,5 μl Zelllyse-Mastermix (Bestandteile des WGA-Kits, Tabelle der Materialien und Reagenzien) für WGA hinzugefügt.
   1. Bereiten Sie den Zelllyse-Mastermix nach Czyż et al. vor, indem Sie 5,0 μl Reaktionspuffer, 1,3 μl Octylphenoxypolyethoxyethanol (10%ige Lösung), 1,3 μl 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylenglykol (10%ige Lösung) bzw. 2,6 μl einer Proteinase-K-Lösung und 34,8 μl RNase/DNase-freies Wasser mischen, um einen Mastermix für 10 Proben (Gesamtvolumen 45 μl) zu erhalten. Lege den Mastermix auf ice.
      Anmerkung: Für mehr Proben erhöhen Sie die Volumina entsprechend.
   2. Behandeln Sie die membranbeschichteten Objektträger mit UV-Beschichtung, die für die Lasermikrodissektion geeignet sind. Legen Sie die Objektträger in ein DNA-Vernetzergerät und belichten Sie sie für ca. 10 min der höchsten UV-Strahlung
   .
   3. Den membranbeschichteten Objektträger in eine Zytozentrifuge einbauen und die gesamte Zellsuspension bei 300 x g für 5 min.
      cytospinnieren Anmerkung: Bei Verwendung eines In-Liquid-Systems, bei dem die Zellen auf den Objektträger in Lösung zytozentrifugiert werden, entfernen Sie den Überstand nach der Zytozentrifugation und wenden Sie einen Dry-Spin bei 1140 x g für 1 min an.
   4. Fahren Sie direkt mit der Lasermikrodissektion fort oder lassen Sie die Cytospins über Nacht an der Luft trocknen und frieren Sie die Proben für die Langzeitlagerung bei -20 °C ein.
   5. Pipettieren Sie 4,5 μl des Zelllyse-Mastermixes in den Deckel eines 0,2 mL PCR-Röhrchens und entnehmen Sie einzelne Zellen mittels Lasermikrodissektion.
   6. Nehmen Sie das PCR-Röhrchen aus dem Laser-Mikrodissektionsmikroskop und verschließen Sie das Röhrchen. Sammeln Sie die gesamte Flüssigkeit am Boden des Röhrchens durch kurzes Schleudern und legen Sie die Probe auf Eis.
   7. Fahren Sie mit einer einzelligen WGA fort oder lagern Sie die isolierten Proben bis zu 1 Monat lang bei -80 °C, bevor Sie sie weiterverarbeiten.