Method Article

Einzelzellprobenahme mittels Laser-Capture-Mikrodissektion: Eine Technik zur Gewinnung von Zielzellen aus einer heterogenen Zellpopulation

April 30th, 2023

In This Article

Abstract

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Quelle: Chen S. et al. Zielzell-Voranreicherung und Ganzgenom-Amplifikation für die Downstream-Charakterisierung einzelner Zellen. J. Vis. (2018)

Dieses Video beschreibt die Technik zur Gewinnung einer einzelnen Zelle aus einer heterogenen Zellpopulation mittels Laser-Capture-Mikrodissektion. Die einzelne isolierte Zelle kann für weitere genomische Studien oder die Krebsforschung verwendet werden.

Protocol

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

>1. Einzelzell-Probenahme

  1. Laser-Mikrodissektion
    HINWEIS: Einzelne Zellen werden zu 4,5 μl Zelllyse-Mastermix (Bestandteile des WGA-Kits, Tabelle der Materialien und Reagenzien) für WGA hinzugefügt.
    1. Bereiten Sie den Zelllyse-Mastermix nach Czyż et al. vor, indem Sie 5,0 μl Reaktionspuffer, 1,3 μl Octylphenoxypolyethoxyethanol (10%ige Lösung), 1,3 μl 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylenglykol (10%ige Lösung) bzw. 2,6 μl einer Proteinase-K-Lösung und 34,8 μl RNase/DNase-freies Wasser mischen, um einen Mastermix für 10 Proben (Gesamtvolumen 45 μl) zu erhalt....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
McCoy's 5A Medium (1x) Suppl. mit L-GlutaminThermo Fisher ScientificTel.: 16600-082Kulturmedium für HT-29-Zellen, Anpassung des Kulturmediums an die für die Experimente verwendete Zelllinie
HEPES-Pufferlösung (1 m)PAANr. S11-001Ergänzung für McCoy's 5A Medium
Fötales Rinderserum GoldPAANr. A15-151Nachtrag für McCoy's 5a Modified Medium
Penicillin-Streptomycin (100x)Biowest (Biowesten)Nr. L0018-100Nachtrag für McCoy's 5a Modified Medium
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1x PBS)Thermo Fisher ScientificTel.: 10010-015
AccutaseBiowest (Biowesten)Nr. L0950-100Lösung zur Zellablösung (Zellkultur)
WasserbadDaFTyp 1003Wird zum Vorwärmen von Lösungen verwendet
BrutkastenThermo Fisher ScientificWird zur Inkubation von Zellen (Zellkultur) verwendet
50 mL ReaktionsgefäßeVWRArtikel-Nr.: 525-0403
WalzenmischerStuart WissenschaftlichSRT6DWird verwendet, um Zellen am Draht zu befestigen und gleichzeitig zu verhindern, dass die Zellen sedimentieren
CellTrace CFSE-Kit zur ZellproliferationThermo Fisher ScientificNr. C34554Wird verwendet, um lebende Zellen zu markieren (zytoplasmatische Markierung)
Hoechst 33342Nr. H3570Thermo Fisher ScientificWird zum Färben von DNA (Nuklein-Gegenfärbung)
Zentrifuge (ausgestattet für 15 mL und 50 mL Reaktionsgefäße)Thermo Fisher ScientificHeraeus Megafuge 40RWird für die Pelletierung von Zellen verwendet
Observer Z1 (Fluoreszenz-/Laser-Mikrodissektionsmikroskop)Carl Zeiss MikrobildgebungInverses Mikroskop (Immunfluoreszenz), das Lasermikrodissektion durchführen kann; Fluoreszenzmikroskope müssen in der Lage sein, Hoechst 33342 (DAPI-Filter) und CFSE (FITC-Filter) zu detektieren
Rinderserumalbumin (BSA)Sigma-AldrichA4503-50GWird zur Beschichtung von Glas-/Kunststoffoberflächen verwendet
MS1 Mini-ShakerSigma-AldrichZ404039Wird zum Vortexen verwendet
Detektor CANCER03 DC03GilupiGIL003Funktionalisierter Draht, der in der Lage ist, EpCAMpositive Zellen zu isolieren und zu lösen (auch als Catch&Release, C&R bezeichnet)
Spritzennadeln (G20)VWRTel.: 613-0554Wird verwendet, um Gummikappen zu durchstechen, damit der nicht funktionsfähige Teil des C&R hindurchführen kann
Neubauer-KammerRothNr. T729.1Wird verwendet, um Zellen zu zählen
Pasteurpipetten 150 mmVolacNr. D810Wird für die Anwendung von Zellen mit geringem Volumen auf den C&R
Fett-StiftDakoNr. 2002Wird auf Objektträgern verwendet, um die Zellsuspension an Ort und Stelle zu halten
Delfia PlateShakerPerkin ElmerTel.: 1296-003Wird zum Rühren während der Zellablösung verwendet
1,5 mL RöhrchenEppendorf30.125.150
Ampli1 WGA-BausatzSilizium-BiosystemeZu bestellen über Silicon Biosystems
0,2 mL PCR-RöhrchenBiozymArtikel-Nr.: 710920
Zytozentrifuge und AusrüstungHettichUniversell 32Verwenden Sie die Zytozentrifuge zur Hand
ThermocyclerBio-RadDNA-Engine-DyadeJeder Thermocycler mit beheiztem Deckel kann verwendet werden
MikrozentrifugeRothCX73.1Verwenden Sie eine Tischzentrifuge zur Hand
UV-Stratalinker 1800Stratagene400072Verwenden Sie den DNA-Vernetzer zur Hand
verwendet verwendet

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Laser Capture MicrodissectionSingle Cell IsolationCytocentrifuge TechniqueCell Suspension PreparationMembrane Coated SlideUV Light TreatmentCell Lysis Master MixPCR Tube CollectionHeterogeneous Cell PopulationTarget Cell Harvesting

Related Articles