Intraprostatische Injektion von Krebszellen: Eine Technik zur Verabreichung von Krebszellen zur Etablierung eines orthotopen Prostatakrebs-Mausmodells

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Präoperative Mausvorbereitung

HINWEIS: Unterbringen Sie Mäuse mindestens eine Woche vor der Operation in der Tiereinrichtung der Universität, um eine angemessene Anpassung zu ermöglichen und den Stress der Tiere zu minimieren. Die Schritte 1.1-1.6 werden von der Assistentin des Chirurgen durchgeführt. Alle nachfolgenden chirurgischen Schritte werden vom Chirurgen mit sterilen Handschuhen und chirurgischen Instrumenten in steriler Technik durchgeführt.

1. Betäuben Sie die Mäuse mit Isofluran (2-5% für die Induktion über die Kammer, 1-3% für die Erhaltungstherapie über den Nasenkonus). Überprüfen Sie die vollständige Induktion durch den Verlust des Zehenquetschreflexes.
2. Wiegen Sie die Mäuse und verabreichen Sie mindestens 0,05 mg/kg des Analgetikums Buprenorphin s.c.
   Anmerkung: Ein Mausgewicht von ≥20 g ist ideal für erfolgreiche intraprostatische Injektionen.
3. Tragen Sie Augensalbenschmierung auf beide Augen auf, um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern.
4. Rasieren Sie das gesamte Fell vom Bauch ab.
5. Sterilisieren Sie den Bauch durch drei Runden kreisförmiger Anwendung eines chirurgischen Peelings mit sterilen, nicht haftenden Pads, gefolgt von sterilen Alkoholtüchern. Lassen Sie den Bauch trocknen.
   Anmerkung: Für den Rest des chirurgischen Eingriffs dürfen nur sterile Handschuhe und chirurgische Instrumente verwendet werden, um mit dem sterilisierten Mausbauch in Kontakt zu kommen.
6. Übertragen Sie die Maus in Rückenlage auf eine saubere Oberfläche auf einem Heizkissen direkt unter dem Objektiv eines sauberen Operationsmikroskops.
7. Decken Sie die Maus mit einem sterilen Tuch ab, in das ein kleines Loch über dem Bauch geschnitten ist.

>2. Intraprostatische Injektion

HINWEIS: Führen Sie alle chirurgischen Schritte unter sterilen Bedingungen durch. Das Einstellen des Mikroskops, der Platzierung der Maus oder eines anderen unsterilen Objekts muss mit zusätzlicher Hilfe erfolgen.

1. Führen Sie einen etwa 1 cm langen Schnitt der Außenhaut entlang der Mittellinie des Bauches oberhalb des Penis und der Präputialdrüsen durch (Abbildung 1D).
2. Trennen Sie das Bindegewebe zwischen der äußeren Bauchhaut und der inneren Bauchmuskulatur, indem Sie die Schere zwischen den Schichten öffnen.
3. Führen Sie einen ähnlichen Schnitt an den inneren Bauchmuskeln durch und verwenden Sie eine Pinzette, um die Muskeln anzuheben, um eine Punktion des Darms oder der Blase zu vermeiden (Abbildung 1D).
4. Lokalisieren Sie eines der beidseitigen Samenbläschen (Abbildung 1A, weiß)/vorderen Prostatalappen (Abbildung 1A, schwarz), die oft posterior, lateral und leicht über der Blase liegen (Abbildung 1A, gelb), aber dies kann von Maus zu Maus variieren. Die vorderen Prostatalappen sind durchscheinend und an der kleineren Krümmung der weißen Samenbläschen befestigt.
5. Heben Sie die Spitze der Samenblase vorsichtig mit der Graefe-Gewebezange an, um Spannung auf das Gewebe zu erzeugen, ohne die Samenblase zu punktieren (Abbildung 1E).
6. Mischen Sie die Myc-CaP-Matrigellösung durch gentiles Pipettieren (durchgeführt von der Chirurgenassistentin), da die Zellen pelletiert sein können, und aspirieren Sie langsam 30 μl (1x10⁶ Zellen) in die Nadel, um Luftblasen zu vermeiden.
7. Führen Sie die Fase der Nadel vorsichtig parallel zur Längsachse des vorderen Prostatalappens ein. Injizieren Sie langsam 30 μl in den Keulen und ziehen Sie die Nadel dann langsam zurück, um ein Auslaufen zu verhindern (Abbildung 1F). Überprüfen Sie die adäquate Injektion durch Verstopfung des vorderen Prostatalappens (Abbildung 1G).
8. Halten Sie das Samenbläschen und den Prostatalappen vorsichtig für ca. 30 s außerhalb der Maus, damit sich das Matrigel teilweise im Lappen verfestigen kann. Während dieser Zeit können Sie mit einem sterilen Applikator mit Polyesterspitze austretende Zelllösung im Bauch auffangen, um die Entwicklung eines nicht-orthotopen Tumors zu verhindern, ohne auf den injizierten Prostatalappen zu drücken.
9. Bringen Sie die Samenblase und den injizierten Prostatalappen vorsichtig in den Bauch zurück, ohne Druck auf den Lappen auszuüben. Ersetzen Sie alle externalisierten Gewebe.
10. Führen Sie kontinuierliche Nähte durch, um die inneren Bauchmuskeln mit 5-0 vicryl resorbierbaren Reverse-Cutting-Nadelnähten zu schließen.
11. Führen Sie unterbrochene Nähte durch, um die äußere Bauchhaut mit 4-0 Nylon-Monofilamenten, nicht resorbierbaren Nadelnähten mit umgekehrtem Schnitt zu schließen. Anmerkung: Sterilisierte 9 mm Klammern können auch zum Verschließen der äußeren Bauchhaut verwendet werden. Im Gegensatz zu Nähten stören sie jedoch jedes nachfolgende biolumineszierende und fluoreszierende Tumorbildgebungssignal.
12. Reinigen Sie alle Werkzeuge mit sterilen Ethanoltüchern (geöffnet von der Assistentin des Chirurgen) und legen Sie sie für 30 Sekunden in einen Glasperlensterilisator. Lassen Sie die Werkzeuge trocknen, bevor Sie sie mit der nächsten Maus verwenden.
Spülen
13. Sie die Spritze und die Nadel mit steriler Kochsalzlösung (die von der Assistentin des Chirurgen geöffnet wird), um ein Verstopfen durch Matrigelreste zu verhindern.
    Anmerkung: Bei allen Operationen sollte ein Chirurgenassistent anwesend sein, der alle unsterilen präoperativen Mauspräparationen und postoperativen Mäusebehandlungen durchführt und die Myc-CaP-Matrigellösung vor den Injektionen mischt. Um den Zeitaufwand zu minimieren, da jeder Eingriff an der intraprostatischen Maus 20-30 Minuten dauert, kann der Chirurgenassistent mit der Vorbereitung der nächsten Maus beginnen, während der Chirurg die aktuelle Maus näht.

>3. Postoperative Mausversorgung

1. 1 mg/kg des Analgetikums Meloxicam s.c. unverzüglich, 24 h und 48 h nach der Operation verabreichen.
2. Lassen Sie die Mäuse sich in einem Käfig ohne Einstreu erholen, der halb auf einem Heizkissen platziert ist. Überwachen Sie die Mäuse nach der Operation mindestens 30 Minuten lang, bis sie wieder normal beweglich und aktiv sind, und setzen Sie sie danach in einen sauberen Käfig mit Futter auf dem Boden des Käfigs.
3. Überwachen Sie die Mäuse weiterhin täglich auf die richtige Wundheilung, das Körpergewicht, die Pflege und den Gehkomfort nach der Operation. Trennen Sie die Mäuse in einzelne Käfige, wenn es Anzeichen von Kämpfen gibt.
4. Entfernen Sie alle verbleibenden Nähte innerhalb von 14 Tagen nach der Operation.

Abbildung 1: Vorderer Prostatalappen, drainierende Lymphknoten und repräsentative Technik für intraprostatische Zellinjektionen. Bilder des (A) rechten vorderen Prostatalappens (schwarz, *), der angesetzten rechten Samenblase (weiß), des rechten Hodens und des Fettpolsters (grün) und der Blase (gelb), (B) der beidseitigen paraaortalen Lymphknoten zur Prostatadrainage (orange), (C) der Mikrodissektionschere, der Graefe-Pinzette, der Graefe-Gewebezange, eines Nadelhalters mit Nahtschneidern und einer 50-μl-Spritze mit einer 28-Gauge-Nadel (von links nach rechts), (D) Mittellinienschnitte, (E) Externalisierung des Samenbläschens und des vorderen Prostatalappens, (F) intraprostatische Injektion und (G) Verstopfung des vorderen Prostatalappens.