Erzeugung chemoresistenter Prostatakrebszellen: Ein Verfahren zur Gewinnung arzneimittelresistenter Krebszellen in vitro

Zusammenfassung

Quelle: Mohr, L. et al. Generierung von Prostatakrebszellmodellen der Resistenz gegen das Antimitotikum Docetaxel. J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video beschreibt ein Protokoll zur Generierung taxanresistenter Zellmodelle von Prostatakrebs. Diese Modelle können helfen, die Signalwege zu untersuchen, die an der Progression zur Docetaxel-Resistenz bei Prostatakrebspatienten beteiligt sind.

Protokoll

>1. Erzeugung von Docetaxel-resistenten Prostatakrebszellen

HINWEIS: Führen Sie Zellbehandlungen mit Docetaxel-Lösungsmaterial durch, das zur Bestimmung der IC50-Wirkstoffkonzentration verwendet wird (bereiten Sie genügend Material im Voraus für den experimentellen Gebrauch vor). Die Elternzellen sollten während des gesamten Verfahrens parallel in einem kleinen Kolben gezüchtet und dem Vehikel (DMSO) in entsprechenden Volumina ausgesetzt werden, die den in den mit Docetaxel behandelten Kolben verwendeten Mengen entsprechen.

1. Platte DU145 oder 22Rv1 Zellen in^{150 cm 2} Kolben mit 20 mL Medium (3,5 x 10⁶ Zellen pro Kolben für DU145 und 6,5 x 10⁶ Zellen pro Kolben für 22Rv1). Die Verwendung von 10 bis 20 Flaschen Zellen wird empfohlen, um am Ende des Protokolls genügend Zellen zu haben.
2. Nach 24 Stunden, wenn die Zellen bei etwa 70-80 % Konfluenz sind (Abbildung 1B, vor Docetaxel), fügen Sie Docetaxel in der IC50-Konzentration hinzu (5 nM für die in diesem Protokoll beschriebenen Zellen).
3. Nach 72 h aspirieren Sie arzneimittelhaltige Medien und fügen frische, Docetaxel-freie Medien hinzu (Abbildung 1B, 72 h nach Docetaxel). Wechseln Sie das Medium alle 3-4 Tage. Innerhalb von etwa 1-2 Wochen erscheinen resistente Klone unter dem Mikroskop sichtbar (Abbildung 1B, 7 und 14 Tage nach Docetaxel).
4. Das Medium wird aspiriert, die Zellen sorgfältig mit 15 ml PBS gewaschen und mit 4 ml 0,05 % Trypsin-EDTA für 3-5 min bei 37 °C inkubiert, um die Zellen von der Kolbenoberfläche zu lösen.
5. Trypsinisierte Zellen aus dem Kolben mit 8 ml frischem Medium resuspendieren. Poolzellen aus allen behandelten Kolben. Pelletzellen durch Zentrifugation (300 x g, 3 min, RT).
6. Entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Zellpellet in 20 mL frischem Medium und plattieren Sie die Zellen in 150 cm² Kolben (3,5 x 10⁶ Zellen pro Kolben für DU145 und 6,5 x 10⁶ Zellen pro Kolben für 22Rv1).
7. Nach 24 Stunden, wenn die Zellen bei etwa 70-80% Konfluenz sind, fügen Sie erneut 5 nM Docetaxel (anfängliche IC50-Konzentration) hinzu.
8. Wiederholen Sie die Schritte 1.3 bis 1.6 an Tag 3.
9. Nach 24 Stunden, wenn die Zellen bei etwa 70-80% Konfluenz sind, behandeln Sie sie mit einer 2-fachen IC50-Docetaxel-Konzentration (10 nM für die in diesem Protokoll beschriebenen Zellen).
10. Wiederholen Sie die Schritte 1.3 bis 1.8 nach einer Dosissteigerung der Docetaxel-Konzentrationen (25 nM, 50 nM, 100 nM und 250 nM), um eine stabile Population von Zellen zu erzeugen, die in den Kolben unter der endgültigen höchsten Konzentration wachsen. Bei höheren Konzentrationen kann das Dosis-Eskalationsprotokoll bis zu 6 Monate lang angewendet werden, bis die Konzentration von 1.000 nM erreicht ist (Abbildung 2A).

Ergebnisse

Abbildung 1: Generierung von Docetaxel-resistenten Prostatakarzinom-Zellmodellsystemen.(A) Diagramm, das die Bestimmung des Docetaxel IC50 in den elterlichen Prostatakrebszelllinien DU145 und 22Rv1 darstellt (Schritt 1 des Protokolls). Die erwarteten Prozentsätze der Zellviabilität und die erforderlichen dosissteigernden Docetaxel-Konzentrationen sind enthalten. Repräsentative DU1...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DU145-Zellen	ATCC	HTB-81
22Rv1-Zellen	ATCC	CRL-2505
Docetaxel	Selleck Chemikalien	Nr. S1148	in DMSO (10mM)
Gewebekulturkolben 150cm^{2}	Falke	355001
RPMI 1640 Mittel	Gibco	11875093	Ergänzt mit 10% FBS und 1% Penicilin/Streptomycin
Foundation B Fötales Rinderserum	Zwillinge	900208
1X Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Corning	21-040-CM
0,05%Trypsin-EDTA	Gibco	Artikel-Nr.: 25300-062
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122