Charakterisierung der funktionellen Chemoresistenz: Eine Methode zur Bewertung der Arzneimittelresistenz in Krebszellen mit einem klonogenen Assay

Zusammenfassung

Quelle: Mohr, L. et al. Generierung von Prostatakrebszellmodellen der Resistenz gegen das Antimitotikum Docetaxel. J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video beschreibt eine Methode zur Bewertung der chemotherapeutischen Arzneimittelresistenz in Prostatakrebszellen mittels Koloniebildungsassay. Dieser Assay kann als funktionelles Werkzeug verwendet werden, um neue molekulare und zelluläre Mechanismen der Chemoresistenz in Krebszellen zu identifizieren.

Protokoll

1. Funktionelle Charakterisierung der erworbenen Docetaxel-Resistenz durch Koloniebildungsassay

HINWEIS: In diesem Protokoll wurde die Chemoresistenz mit Hilfe von Koloniebildungsassays bewertet. Alternative Methoden zur Bewertung der Zellviabilität (z. B. MTS-Assays) können je nach Präferenzen der Prüfärzte verwendet werden.

1. Plattieren Sie 2.000 Zellen (DU145 oder 22Rv1, sowohl elterlich als auch Docetaxel-resistent) pro Well in 6-Well-Platten mit 2 ml Medium pro Well.
2. Nach 24 Stunden werden steigende Konzentrationen von Docetaxel (Elternzellen: 0,25, 0,5, 1, 2,5 und 5 nM; DR-Zellen: 50, 125, 250, 500 und 1.000 nM). Sowohl für DU145- als auch für 22Rv1-Zelllinien. Geben Sie DMSO nur in eine Vertiefung als Kontrolle mit der gleichen Lautstärke, die für die höchste Docetaxel-Dosis verwendet wird.
3. Nach 72 h aspirieren Sie das arzneimittelhaltige Medium und fügen Sie frisches Docetaxel-freies Medium hinzu.
4. Inkubieren Sie die Platten 1-2 Wochen lang, bis die Kolonien unter dem Mikroskop sichtbar sind.
5. Um die Kolonien zu färben, waschen Sie sie vorsichtig mit 2-3 ml PBS und inkubieren Sie sie mit 2-3 ml kristallvioletter Lösung (0,1 % w/v in 10 % Formalin) für 20 Minuten in der Gewebekulturhaube oder einem Abzug.
6. Fleckenlösung entfernen, Platten mit 2-3 mL H₂O waschen, H₂O entfernen und Platten an der Luft trocknen.
7. Analysieren Sie das Ergebnis, indem Sie die Vertiefungen visualisieren und die Kolonien mit Hilfe eines Markierungsstifts manuell zählen (um zu vermeiden, dass dieselben Kolonien zweimal gezählt werden) und stellen Sie den Prozentsatz der Zellviabilität in einem Diagramm dar. Machen Sie digitale Bilder der Platten für die Darstellung der Figur (Abbildung 1A).

Ergebnisse

Abbildung 1: Funktionelle und phänotypische Charakterisierung der Docetaxel-resistenten Zellmodelle.(A) Repräsentative Koloniebildungstests von elterlichen und Docetaxel-resistenten Zellen, die 72 Stunden lang mit den angegebenen Docetaxel-Konzentrationen behandelt wurden. Der prozentuale Anteil der Kolonien für jede Behandlungskonzentration ist in der beigefügten Grafik dargestel...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DU145-Zellen	ATCC	HTB-81
22Rv1-Zellen	ATCC	CRL-2505
Docetaxel	Selleck Chemikalien	Nr. S1148	in DMSO (10mM)
Gewebekulturflasche 150 m²	Falke	355001
6-Well-Gewebekulturplatten	Falke	353046
RPMI 1640 Mittel	Gibco	11875093	Ergänzt mit 10% FBS und 1% Penicilin/Streptomycin
Foundation B Fötales Rinderserum	Zwillinge	900208
1X Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Corning	21-040-CM
0,05%Trypsin-EDTA	Gibco	Artikel-Nr.: 25300-062
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Kristall Violett	Sigma-Aldrich	Nr. C0775
10% Formalin-Lösung	Sigma-Aldrich	HT501128