>1. Zellen für die Live-Bildgebung vorbereiten
- Züchten Sie CWR22Rv1-Zellen, die grün fluoreszierende, proteingekoppelte Leichtkette 3 (LC3-GFP) exprimieren, in RPMI-Kulturmedien, die 10 % FBS und 1 % Antibiotika enthalten, auf 35 mm Poly-D-Lysin-beschichteten Kulturschalen mit Glasboden. Die Zellen sollten mit ausreichender Dichte plattiert werden, um eine schnelle Proliferation zu ermöglichen, aber nicht so sehr, dass die Zellen zum Zeitpunkt der Bildgebung überwachsen und verklumpt sind.
- Behandeln Sie ausgewählte Zellproben mit ADI (0,3 μg/ml) in PBS.
- Etwa 1 Stunde vor der Bildgebung verdünnen Sie 1,5 μl LysoTracker Red DND-99 (Invitrogen, CA) mit 20 ml RPMI, die 10 % FBS und 1 % Antibiotika enthalten. Für ausgewählte Proben sind Lösungen mit ADI-Gehalt zu verwenden. Erwärmen Sie alle Medien auf 37 °C, bevor Sie sie in die Kulturschale geben.
- Inkubieren Sie Zellen mit RPMI, die LysoTracker Red DND-99 enthalten, für 15-45 min bei 37 °C.
- Schalten Sie ca. 30 Minuten vor der Bildgebung das Umgebungsgehäuse der WeatherStation ein und lassen Sie es auf 37 °C und 5 % CO2 (mit befeuchteter Luft) ausgleichen.
- Waschen Sie die Zellen mit PBS und ersetzen Sie Medien durch Standard-RPMI, die nur 10 % FBS und 1 % Antibiotika enthalten. ADI wie angegeben zu den Proben hinzufügen.
- Montieren Sie 35-mm-Kulturschalen mit Deckglasboden in einem kundenspezifischen Adapter (Applied Precision, Inc., WA) und positionieren Sie sie auf dem Mikroskoptisch. Verwenden Sie Immersionsöl (Brechungsindex 1,520) auf der 60X 1,42 NA Objektivlinse und positionieren Sie die montierte Kulturschale auf dem Tisch.
2. Superhochauflösende Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung (OMX)
HINWEIS: Das Protokoll in diesem Abschnitt gilt für die Verwendung des OMX Structured Illumination Microscope (Applied Precision, WA).
- Schalten Sie die Hauptstromversorgung und die gewünschten Laser (410 nm, 488 nm und/oder 532 nm) ein. Warten Sie 20 Minuten, bis die Laser thermisch stabilisiert sind.
- Geben Sie Immersionsöl (Brechungsindex 1,516 für feste Proben bei RT) auf das Objektiv 60X 1,42 NA. Wenn Blasen im Öltropfen zu sehen sind, reinigen Sie das Objektiv und fügen Sie erneut Öl hinzu.
- Legen Sie den Objektträger auf den Tisch und warten Sie gegebenenfalls 10 Minuten, bis sich die Zellen auf dem Deckglas abgesetzt haben.
- Initialisieren Sie das Akquisitionsprogramm. Verwenden Sie eine Fluoreszenzbeleuchtung, um den Fokus so lange einzustellen, bis ein scharfer Umriss der Zelle zu sehen ist.
Anmerkung: Es sollte jederzeit darauf geachtet werden, dass die Zellen bis zur eigentlichen Bildaufnahme so wenig wie möglich einer Fluoreszenzanregung ausgesetzt sind.
- Ein Spiralmosaik-Scan kann erfasst werden, um größere Bereiche der Probe in der Vorschau anzuzeigen und Zellen oder Bereiche von Interesse auszuwählen. Es wird empfohlen, beim Scannen der Probe oder beim Auffinden von Zielen kurze Belichtungszeiten (1-10 ms) und eine geringe Anregungsleistung (0,1-1 % Transmission) zu verwenden.
- Identifizierung von Autophagosomen durch GFP-LC3-Fluoreszenz. Identifizieren Sie Lysosomen mittels Alexa Fluor 555 anti-LAMP (Lysosomen-assoziiertes Membranprotein) und Zellkerne mit DAPI (fixierte Proben).
- Wählen Sie experimentelle Bedingungen wie Anregungswellenlänge, Bildbereich (z. B. 512 x 512), Stapeldicke, Belichtungszeit und Prozentsatz der Lasertransmission. Stellen Sie für Bilder mit hoher Auflösung sicher, dass die Option für strukturierte Beleuchtung aktiviert ist. Für die Entfaltungsmikroskopie auf dem OMX wählen Sie die konventionelle Beleuchtungsoption.
- Um die besten Rekonstruktionsergebnisse zu erzielen, wählen Sie die Versuchsbedingungen so, dass die maximale Intensitätszahl während der Aufnahme zwischen 10.000 und 15.000 liegt. Wenn Photobleaching ein Problem darstellt, kann die Bildgebung bei einer niedrigeren Belichtung (Zählungen zwischen 5.000 und 10.000) verwendet werden. Im Idealfall sollten die Zählungen während der gesamten Erfassung nicht um mehr als den Faktor zwei abnehmen, und eine Abnahme um mehr als den Faktor vier sollte vermieden werden. Reduzieren Sie bei Bedarf die Stapeldicke, um eine anhaltende Intensitätszahl zu gewährleisten. Die Kamera ist bei 64.000 Zählungen gesättigt, sodass die maximale Intensität diesen Wert nie überschreiten sollte. Für gute Proben stellten wir fest, dass die experimentellen Bedingungen eine Belichtungszeit von 10 ~ 50 ms mit 1% Lasertransmission betrugen. Helle und photostabile Proben, die wiederholt abgebildet werden können, werden bevorzugt. Ein stabiler Fleck ist für superaufgelöste Zeitrafferbilder erforderlich.
- Um das Rauschen zu reduzieren, wird eine Auslesegeschwindigkeit von 95 MHz (Option mit mittlerer Geschwindigkeit) und eine Erfassungszeit von 2 ms oder mehr empfohlen. Erhöhte Artefakte werden im rekonstruierten Bild erhalten, wenn sich die Probe während der Aufnahme bewegt. Aufgrund dieses Effekts werden kurze Expositionen für nicht adhärente oder sich schnell bewegende Zellen empfohlen.
- Die Mehrkanal-Bildgebung kann gleichzeitig oder sequentiell durchgeführt werden. Der sequentielle Modus führt zu weniger Übersprechen und wird daher empfohlen.
- Um das Photobleaching zu reduzieren, wird generell empfohlen, zunächst mit längeren Anregungswellenlängen (532 nm, 488 nm und dann 410 nm) abzubilden. Für die in Abbildung 1 gezeigten experimentellen Ergebnisse wurde diese Reihenfolge jedoch aufgrund der Photostabilität dieser speziellen Probe umgekehrt (d. h. 48 nm, 532 nm und 410 nm).
- Legen Sie die obere/untere Grenze des Z-Stapels fest, indem Sie den Mikroskoptisch bewegen, bis der obere/untere Rand der Küvetten leicht unscharf ist. Der gewünschte Abstand zwischen den einzelnen Bildern sollte für die hochauflösende Bildgebung konstant bei 0,125 μm gehalten werden, da die Rekonstruktionssoftware diesen Wert als Standard annimmt.
- Rekonstruieren Sie Bildstapel mit SoftWorX (Applied Precision, WA) und analysieren Sie sie mit VoloCITY 6.0 (Perkin Elmer, MA).
