Proteinextraktion und Proteolyse: Eine Methode zur Gewinnung von Proteinen aus Prostatatumorgewebeproben und deren enzymatischer Verdau in Peptide

Zusammenfassung

Quelle: Cheng, L. C. et al. Phosphopeptid-Anreicherung gekoppelt mit markierungsfreier quantitativer Massenspektrometrie zur Untersuchung des Phosphoproteoms bei Prostatakrebs. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video beschreibt die Technik der Proteinextraktion und -verdauung, um Peptide aus Prostatatumorgewebe zu erhalten. Diese Peptide können bei weiterer Analyse dazu beitragen, neue Ziele für die Onkotherapie zu identifizieren.

Protokoll

>1. Protein-Extraktion

1. Bereiten Sie den Lysepuffer vor (Tabelle 1). (Das Volumen hängt von der Anzahl der zu erntenden Proben ab.)
2. Entnahme von Geweben
   1. Wiegen Sie den Tumor und fügen Sie 2 ml eiskalten Lysepuffer pro 100 mg Gewebe in einem Kulturreagenzglas hinzu. (In der Regel werden 50 bis 150 mg Nassgewicht des Gewebes benötigt.)
3. Homogenisieren Sie das Lysat mit einem Hand- oder Tischhomogenisator (2x Puls für 15 s). Reinigen Sie den Homogenisator vor der ersten Probe und zwischen den Proben, indem Sie nacheinander 10 % Bleichmittel, 70 % Ethanol und entionisiertes Wasser verwenden.
4. Zum Reduzieren und Alkylieren erhitzen Sie die homogenisierten Proben 5 Minuten lang auf 95 °C. Dann 15 Minuten auf Eis abkühlen lassen. Auf Eis das Lysat 3x beschallen (d.h. 30 s pulsieren mit 60 s Pausen zwischen den Impulsen). Die Probe sollte zu diesem Zeitpunkt nicht zähflüssig oder klumpig sein. Das Lysat 5 min lang auf 95 °C erhitzen.
5. Das Lysat wird im selben Beschallungsröhrchen mit einem Ausschwingrotor bei 3.500 x g bei 15 °C für 15 min zentrifugiert. Den Überstand auffangen und das Pellet entsorgen.
6. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration, indem Sie einen Bradford-Assay durchführen. Falls erforderlich, verdünnen Sie das Lysat auf 5 mg/ml mit einem Lysepuffer. Bei -20 °C lagern.
   HINWEIS: Das Experiment kann hier pausiert werden. Frieren Sie die Proben bei -80 °C ein und verwenden Sie sie für die weitere Analyse.

>2. Lysat-Aufschluss

1. Verdünnen Sie die Probe um das 12-fache mit 100 mM Tris (pH = 8,5), um die Menge an Guanidinium zu reduzieren. Verdünnen Sie alle Proben auf das gleiche Volumen, um die Auswirkungen eines ungleichmäßigen Aufschlusses zu minimieren. Bewahren Sie 12,5 μg des unverdauten Lysats auf, um es auf einem Coomassie-gefärbten Gel zu bestätigen.
2. Für 5 mg Protein fügen Sie 10 μg Lysyl-Endopeptidase (Lys-C) hinzu und inkubieren Sie es bei Raumtemperatur für 5-6 h. Stellen Sie den pH-Wert auf 8,0 ein, indem Sie 1 M untitriertes Tris (pH ~11) hinzufügen.
3. Bereiten Sie 1 mg/ml L-1-Tosylamido-2-phenylethyl-chlormethylketon (TPCK)-behandeltes Trypsin in 1 mM HCl (mit 20 mM CaCl₂) vor. Fügen Sie das Trypsin in einem Trypsin:Protein-Verhältnis von 1:100 hinzu und inkubieren Sie es 3 h lang bei 37 °C.
4. Fügen Sie die gleiche Menge frisches Trypsin wie in Schritt 2.3 hinzu. Inkubieren Sie es über Nacht bei 37 °C.
5. Bewahren Sie 12,5 μg des verdauten Lysats auf, um den vollständigen Aufschluss auf einem Coomassie-gefärbten Gel zu bestätigen.

>3. Umkehrphasen-Extraktion

1. Notieren Sie das Lysatvolumen. Filtern Sie die Probe mit einem 15 mL 10 kDa Sperrfilter. Zentrifugieren Sie die Probe bei 3.500 x g mit dem Ausschwingrotor (oder 3.500 x g in einem Festwinkelrotor) bei 15 °C, bis das Retentatvolumen weniger als 250 μl beträgt (dies dauert ca. 45-60 min). Sammeln Sie den Durchfluss, und verwerfen Sie das Retentat.

Tabelle 1: Puffer und Lösungen.Diese Tabelle zeigt die Zusammensetzung der Puffer und Lösungen, die in diesem Protokoll verwendet werden.

Puffer	Volumen	Zusammensetzung
6 M Guanidiniumchlorid-Lysepuffer	50 mL	6 M Guanidiniumchlorid, 100 mM Tris pH 8,5, 10 mM Tris (2-Carboxyethyl) Phosphin, 40 mM Chloracetamid, 2 mM Natriumorthovanadat, 2,5 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM β-Glycerophosphat, 500 mg n-Octylglykosid, Reinstwasser pro Volumen
100 mM Natriumpyrophosphat	50 mL	2,23 g Natriumpyrophosphat-Decahydrat, Reinstwasser pro Volumen
1M β-Glycerophosphat	50 mL	15,31 g β-Glycerophosphat, Reinstwasser pro Volumen
5% Trifluoressigsäure	20 mL	1 mL 100%ige Trifluoressigsäure in 19 mL Reinstwasser geben
0,1 % Trifluoressigsäure	250 mL	Geben Sie 5 mL 5%ige Trifluoressigsäure in 245 mL Reinstwasser
pY-Elutionspuffer	250 mL	0,1 % Trifluoressigsäure, 40 % Acetonitril, Reinstwasser pro Volumen
pST-Elutionspuffer	250 mL	0,1 % Trifluoressigsäure, 50 % Acetonitril, Reinstwasser pro Volumen
IP-Bindungspuffer	200 mL	50 mM Tris pH 7,4, 50 mM Natriumchlorid, Reinstwasser pro Volumen
25 mM Ammoniumbicarbonat, pH 7,5	10 mL	19,7 mg in 10 mL sterilem Reinstwasser mit einem pH-Wert von 7,5 und 1 N Salzsäure (~10-15 μL/10 ml Lösung) auflösen, frisch machen
1M Phosphatpuffer, pH 7	1.000 mL	423 mL 1 M Natriumdihydrogenphosphat, 577 mL 1 M Natriumhydrogenphosphat
Äquilibrierungspuffer	14 mL	6,3 mL Acetonitril, 280 μL 5% Trifluoressigsäure, 1740 μL Milchsäure, 5,68 mL Reinstwasser
Puffer zum Spülen	20 mL	9 mL Acetonitril, 400 μL 5 % Trifluoressigsäure, 10,6 mL Reinstwasser
Lösung für die Massenspektrometrie	10 mL	500 μl Acetonitril, 200 μl 5%ige Trifluoressigsäure, 9,3 mL Reinstwasser
Puffer A	250 mL	5 mM Monokaliumphosphat (pH 2,65), 30 % Acetonitril, 5 mM Kaliumchlorid, Reinstwasser pro Volumen
Puffer B	250 mL	5 mM Monokaliumphosphat (pH 2,65), 30 % Acetonitril, 350 mM Kaliumchlorid, Reinstwasser pro Volumen
0,9 % Ammoniumhydroxid	10 mL	300 μL 29,42 % Ammoniumhydroxid, 9,7 mL Reinstwasser

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ultra-Tiefkühlschrank	Panasonic	MDF-U76V
Gefrierschrank -20 °C	VWR	SCPMF-2020
Ausschwingrotor-Schaufel	ThermoFisher Scientific	75004377
Ende-über-Ende-Rotator	ThermoFisher Scientific	Artikel-Nr.: 415110Q
Eppendorf-Röhrchen mit geringer Proteinbindung	Eppendorf	22431081
Trypsin, TPCK-Behandlung	Worthington Biochemikalien	LS003740
Lysyl-Endopeptidase	Verifizierter Lieferant - Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	Tel.: 125-05061
MilliQ Wasser			deionisiertes Wasser, das zur Herstellung aller Lösungen und Puffer verwendet wird
Schall-Dismembrator	Fisher Scientific	FB-120	Ultraschallgerät
Polytron System PT	Kinematica AG	PT 10-35 GT	Homogenisator

GmbH