Peptidaufreinigung: Eine RP-HPLC-basierte Technik zur Extraktion von Peptiden aus verdauten Proteinlysaten

Zusammenfassung

Quelle: Cheng, L. C. et al. Phosphopeptid-Anreicherung gekoppelt mit markierungsfreier quantitativer Massenspektrometrie zur Untersuchung des Phosphoproteoms bei Prostatakrebs. J. Vis. Exp. (2018)

In diesem Video demonstrieren wir die Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie zur Aufreinigung von Peptiden aus einer verdauten Proteinlysatmischung. Diese aufgereinigten Peptide werden dann lyophilisiert und für nachgelagerte Anwendungen gelagert. Die Analyse von Peptiden kann helfen, die Mechanismen zu verstehen, die an der zellulären Signalübertragung und Krebs beteiligt sind.

Protokoll

>1. Umkehrphasen-Extraktion

1. Beginnen Sie mit einem vorverdauten Proteinlysat in einem Glasfläschchen. Filtern Sie die Probe mit einem 15 mL 10 kDa Sperrfilter. Zentrifugieren Sie die Probe bei 3.500 x g mit dem Ausschwingrotor (oder 3.500 x g in einem Festwinkelrotor) bei 15 °C, bis das Retentatvolumen weniger als 250 μl beträgt (dies dauert ca. 45 - 60 Minuten). Sammeln Sie den Durchfluss und verwerfen Sie das Retentat.
   NOTE: Das Experiment kann hier pausiert werden. Frieren Sie die Proben für die spätere Verwendung bei -80 °C ein.
2. Um die Probe anzusäuern, fügen Sie ca. 20 μl 5 % Trifluoressigsäure (TFA) pro ml Lysat hinzu. Mischen Sie sie gut und messen Sie den pH-Wert der Probe mit Hilfe von pH-Streifen. Stellen Sie den pH-Wert auf 2,5 mit 5 % TFA ein.
3. Verbinden Sie das kürzere Ende einer C-18-Säule mit einem Vakuumverteiler. Stellen Sie das Vakuum zwischen 17 und 34 kPa ein (oder gemäß den Anweisungen des Herstellers). Befeuchten Sie die Säule mit Glaspipetten mit 3 ml 100 % Acetonitril (ACN). Lassen Sie die Säule nicht trocknen.
4. Äquilibrieren Sie die Säule mit Hilfe von Glaspipetten mit 6 mL 0,1 % TFA, die als 2x 3 mL aufgetragen werden. Laden Sie die angesäuerte Probe in die Säule. Fügen Sie nicht mehr als 3 ml auf einmal hinzu. Stellen Sie das Vakuum so ein, dass es etwa 1 bis 2 Tropfen pro Sekunde beträgt.
5. Waschen Sie die Säule mit Glaspipetten mit 9 ml 0,1 % TFA, die als 3x 3 ml aufgetragen werden. Eluieren Sie die Säule mit 2 mL 40 % ACN, 0,1 % TFA. Sammeln Sie zwei 2-ml-Fraktionen in Glaskulturröhrchen. Verwerfen Sie die Spalte.
6. Decken Sie die Eluatröhrchen mit Parafilm ab und stanzen Sie mit einer 20G-Nadel 3-5 Löcher in die Abdeckung. Frieren Sie das Eluat mindestens 30 min auf Trockeneis ein, bis es vollständig fest wird.
7. Lyophilisieren Sie die Fraktionen über Nacht. Stellen Sie am nächsten Tag sicher, dass die Proben vollständig trocken sind, bevor Sie den Gefriertrockner absetzen. Lagern Sie die Röhrchen in einem konischen 50-ml-Röhrchen mit feinen Tüchern bei -80 °C.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ultra-Tiefkühlschrank	Panasonic	MDF-U76V
Gefrierschrank -20 °C	VWR	SCPMF-2020
Ausschwingrotor-Schaufel	ThermoFisher Scientific	75004377
Vakuum-Verteiler	Restek	Artikel-Nr.: 26080
Lyophilisierer	Labconco	7420020
CentriVap Tisch-Vakuumkonzentrator	Labconco	7810010
Amicon Ultra-15 Zentrifugalfiltereinheiten	Millipore Sigma	UFC901024
Ende-über-Ende-Rotator	ThermoFisher Scientific	Artikel-Nr.: 415110Q
Kulturröhrchen aus Glas	Fisher Scientific	Tel.: 14-961-26
Parafilm	Fisher Scientific	Tel.: 13-374-12
20G Nadel	Bd	B305175
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A
Kryoröhrchen mit Schraubverschluss	ThermoFisher Scientific	379189
Nunc 15 mL konische Röhrchen	ThermoFisher Scientific	Tel.: 12-565-268
Eppendorf-Röhrchen mit geringer Proteinbindung	Eppendorf	22431081
3 mL Spritze	Bd	309657
Trifluoressigsäure (TFA)	Fisher Scientific	PI-28904
Acetonitril (ACN)	Fisher Scientific	Nr. A21-1
MilliQ Wasser			Deionisiertes Wasser, das zur Herstellung aller Lösungen und Puffer verwendet wird