Phosphopeptid-Anreicherung: Eine Antikörper-basierte Immunpräzipitationstechnik zur Trennung spezifischer phosphorylierter Peptide aus komplexen Peptidmischungen

Zusammenfassung

Quelle: Cheng, L. C., et al. Phosphopeptid-Anreicherung gekoppelt mit markierungsfreier quantitativer Massenspektrometrie zur Untersuchung des Phosphoproteoms bei Prostatakrebs. J. Vis. Exp. (2018).

In diesem Video demonstrieren wir die Antikörper-basierte Immunpräzipitation von Phosphopeptiden aus einer Peptidmischung. Die angereicherten Phosphopeptide werden vakuumkonzentriert und für die nachgelagerte Analyse gelagert.

Protokoll

1. Immunpräzipitation und Anreicherung von pY-Peptiden

1. Resuspendieren Sie das lyophilisierte Pulver der gereinigten Peptidverdaue mit 0,5 ml eiskaltem Immunpräzipitationspuffer (IP) in jeder Fraktion. Poolen Sie die Fraktionen, indem Sie das 0,5-ml-Resuspensionsvolumen von der zweiten Fraktion auf die erste Fraktion übertragen und die Pipettenspitze schonen. Kräftig vortexen (anstatt auf und ab zu pipettieren), um sicherzustellen, dass die Probe vollständig aufgelöst ist, bevor sie in ein 3,6-ml-Kryoröhrchen mit Schraubverschluss überführt wird.
2. Spülen Sie die Gefriertrocknungsröhrchen mit weiteren 0,5 ml IP-Bindungspuffer (Tabelle 1) in jedem Röhrchen. Übertragen Sie die Lösung mit derselben Pipettenspitze in das 3,6-ml-Schraubverschlussröhrchen, um den Probenverlust zu minimieren. Wiederholen Sie die Spülung noch 1x, so dass das endgültige Resuspensionsvolumen 2 ml (für 5 mg Protein) beträgt. Messen Sie den pH-Wert der Probe, um sicherzustellen, dass er etwa 7,4 beträgt. Wenn es zu sauer ist, fügen Sie iterativ 10 μl 1M Tris (untitriert, pH ~11) hinzu. Wenn es zu basisch ist, fügen Sie iterativ 10 μl verdünntes HCl (1:25 oder 1:100) hinzu.
3. Waschen Sie die pY-Kügelchen vor (für 5 mg Ausgangslysat)
   1. Pro Probe werden 25 μg 4G10-Antikörper und 12,5 μg 27B10.4-Antikörper benötigt. Nachdem Sie die Antikörper mit einer p200-Pipette mit abgeschnittener Spitze in separate Mikrozentrifugenröhrchen überführt haben, waschen Sie die Antikörper 2x mit 450 μl eiskaltem IP-Bindungspuffer. Bei 100 x g für 1 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand absaugen.
   2. Resuspendieren Sie die Kügelchen mit IP-Bindungspuffer auf eine Stammkonzentration von 0,5 mg/ml. (Die Perlen nicht wirbeln.) Nachdem Sie die erforderliche Aufschlämmung (50 μl 4G10-Antikörperaufschlämmung und 25 μl 27B10.4-Antikörperaufschlämmung pro Probe) in ein einzelnes Röhrchen aliquotiert haben, drehen Sie die Vorratszentrifugenröhrchen bei 200 x g für 1 Minute bei 4 °C herunter. Waschen Sie die Seitenwände mit Überstand, bevor Sie die Kügelchen wieder in den Kühlschrank stellen.
4. Geben Sie vorgewaschene pY-Kügelchen in die resuspendierte Probenlösung in den Kryoröhrchen mit Schraubverschluss. Inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C auf einem durchgehenden Rotator.
5. Legen Sie die Kryoröhrchen mit Schraubverschluss in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen, das mit einem feinen Tuch ausgekleidet ist. Die Perlen bei 100 x g für 1 min runterdrehen. Bewahren Sie den Überstand auf, der zur Anreicherung von pST-Peptiden verwendet wird.
6. Resuspendieren Sie die Kügelchen mit 300 μl IP-Bindungspuffer. Geben Sie sie in ein 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen und schleudern Sie sie bei 100 x g für 1 min bei 4 °C herunter.
7. Spülen Sie das Inkubationsröhrchen 3x mit 200 μl IP-Bindungspuffer. Übertragen Sie den Inhalt jedes Mal in dasselbe Mikrozentrifugenröhrchen. Drehen Sie sie dann nach unten.
8. Waschen Sie die Kügelchen im Mikrozentrifugenröhrchen 3x mit 500 μL IP-Bindungspuffer und schleudern Sie sie bei 100 x g für 1 min herunter. Waschen Sie die Kügelchen dann 4x mit 450 μL 25 mM NH₄HCO₃, pH 7,5, und schleudern Sie sie bei 100 x g für 1 min herunter. Verwenden Sie jedes Mal eine frische 25 mM NH₄HCO₃ Lösung aus Pulver.
9. Zentrifugieren Sie die Kügelchen bei 1.500 x g für 1 min. Verwenden Sie eine Gelladespitze, um den Überstand vollständig zu entfernen, indem Sie die Spitze der Gelladespitze leicht unter die Oberfläche der Kügelchen tauchen.
10. Geben Sie das 4-fache des Bead-Volumens von 0,1 % TFA zu den Kügelchen (d. h. fügen Sie 300 μl 0,1 % TFA für 75 μg pY-Bead-Slurry hinzu). Vermischen Sie sie gut und inkubieren Sie die Mischung in einem Thermomixer bei 1.000 U/min für 15 min bei 37 °C.
11. Die Resuspension wird auf einen 0,2 μm Spinfilter übertragen. Schleudern Sie das Elutionsröhrchen schnell nach unten und übertragen Sie das Restvolumen mit einer P10-Pipette in denselben Spin-Filter. Schleudern Sie den Schleuderfilter bei 850 x g für 1 Min. Übertragen Sie die Elution in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung. Vakuumieren Sie das Eluat über Nacht bei 40 °C und einer Heizzeit von 300 min.
    Anmerkung: Das Experiment kann hier pausiert werden. Frieren Sie die Proben bei -80 °C ein und fahren Sie zu einem späteren Zeitpunkt fort.

Tabelle 1: Puffer und Lösungen.Diese Tabelle zeigt die Zusammensetzung der Puffer und Lösungen, die in diesem Protokoll verwendet werden.

Puffer	Volumen	Zusammensetzung
6 M Guanidiniumchlorid-Lysepuffer	50 mL	6 M Guanidiniumchlorid, 100 mM Tris pH 8,5, 10 mM Tris (2-Carboxyethyl) Phosphin, 40 mM Chloracetamid, 2 mM Natriumorthovanadat, 2,5 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM β-Glycerophosphat, 500 mg n-Octylglykosid, Reinstwasser pro Volumen
100 mM Natriumpyrophosphat	50 mL	2,23 g Natriumpyrophosphat-Decahydrat, Reinstwasser pro Volumen
1M β-Glycerophosphat	50 mL	15,31 g β-Glycerophosphat, Reinstwasser pro Volumen
5% Trifluoressigsäure	20 mL	1 mL 100%ige Trifluoressigsäure in 19 mL Reinstwasser geben
0,1% Trifluoressigsäure	250 mL	Geben Sie 5 mL 5%ige Trifluoressigsäure in 245 mL Reinstwasser
pY-Elutionspuffer	250 mL	0,1 % Trifluoressigsäure, 40 % Acetonitril, Reinstwasser pro Volumen
pST-Elutionspuffer	250 mL	0,1 % Trifluoressigsäure, 50 % Acetonitril, Reinstwasser pro Volumen
IP-Bindungspuffer	200 mL	50 mM Tris pH 7,4, 50 mM Natriumchlorid, Reinstwasser pro Volumen
25 mM Ammoniumbicarbonat, pH 7,5	10 mL	19,7 mg in 10 mL sterilem Reinstwasser mit einem pH-Wert von 7,5 und 1 N Salzsäure (~10-15 μL/10 ml Lösung) auflösen, frisch machen
1M Phosphatpuffer, pH 7	1.000 mL	423 mL 1 M Natriumdihydrogenphosphat, 577 mL 1 M Natriumhydrogenphosphat
Äquilibrierungspuffer	14 mL	6,3 mL Acetonitril, 280 μL 5% Trifluoressigsäure, 1740 μL Milchsäure, 5,68 mL Reinstwasser
Puffer zum Spülen	20 mL	9 mL Acetonitril, 400 μL 5 % Trifluoressigsäure, 10,6 mL Reinstwasser
Lösung für die Massenspektrometrie	10 mL	500 μl Acetonitril, 200 μl 5%ige Trifluoressigsäure, 9,3 mL Reinstwasser
Puffer A	250 mL	5 mM Monokaliumphosphat (pH 2,65), 30 % Acetonitril, 5 mM Kaliumchlorid, Reinstwasser pro Volumen
Puffer B	250 mL	5 mM Monokaliumphosphat (pH 2,65), 30 % Acetonitril, 350 mM Kaliumchlorid, Reinstwasser pro Volumen
0,9 % Ammoniumhydroxid	10 mL	300 μL 29,42 % Ammoniumhydroxid, 9,7 mL Reinstwasser

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Lyophilisierer	Labconco	7420020
CentriVap Tisch-Vakuumkonzentrator	Labconco	7810010
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A
Millipore 0,2 μm Spin-Filter	Millipore Sigma	UFC30GVNB
Eppendorf-Röhrchen mit geringer Proteinbindung	Eppendorf	22431081
Anti-Phosphotyrosin, Agarose, Klon: 4G10	Millipore Sigma	Nr. 16101
27B10.4 Antikörper	Zytoskelett	APY03-Perlen
Peptid-Assay-Kit	Thermo Scientific	Artikel-Nr.: 23275
TopTipp	PolyLC Inc	TT200TIO,96
SCX-Säulen (PolySULFOETHYL A)	PolyLC Inc	SPESE1203
3 mL Spritze	Bd	309657
MilliQ Wasser			Deionisiertes Wasser, das zur Herstellung aller Lösungen und Puffer verwendet wird
Trifluoressigsäure (TFA)	Fisher Scientific	PI-28904
Acetonitril (ACN)	Fisher Scientific	Nr. A21-1
Kaliumchlorid	Fisher Scientific	Nr. BP366-500
Milchsäure	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 69785-250ML
Ammoniakwasser	Fisher Scientific	Nr. A669S-500
Tris Basis	Fisher Scientific	Nr. BP152-5