Titanium Dioxide-based Enrichment of Phosphopeptides: A Method for the Selective Isolation of Phosphopeptides from Peptide Library

doi:10.3791/30051

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Research Article

Titandioxid-basierte Anreicherung von Phosphopeptiden: Ein Verfahren zur selektiven Isolierung von Phosphopeptiden aus der Peptidbibliothek

July 8, 2025

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Abstract

Quelle: Cheng, L. C. et al. Phosphopeptid-Anreicherung gekoppelt mit markierungsfreier quantitativer Massenspektrometrie zur Untersuchung des Phosphoproteoms bei Prostatakrebs. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video zeigt die Titandioxid-basierte Anreicherung von Phosphopeptiden, die aus Prostatatumorgewebe extrahiert wurden. Diese angereicherten Phosphopeptide können für nachgelagerte Anwendungen wie die Proteincharakterisierung verwendet werden, um die zellulären Signalwege zu verstehen, die an der Progression von Prostatakrebs beteiligt sind.

Protocol

>1. Titandioxid-Anreicherung von pY-Peptiden

Resuspendieren Sie die ausgetrockneten Phosphopeptide in 200 μl 50 % ACN, 0,1 % TFA. Vortexen und zentrifugieren Sie sie bei 10.000 x g für 30 s. Wiederholen Sie dies 1x, um sie gut zu resuspendieren.
Vorbereitung der TiO 2-Kügelchen, die in Spitzen enthalten sind, die eine Kapazität von 200 μl Proben haben.
1. Tippen Sie vorsichtig auf die kleine Spitze der Spitze, um das Material zu diesem Ende zu bewegen. Spülen Sie die Spitze aus, indem Sie 200 μl 100 % ACN hinzufügen, dann die Spitze umdrehen und mit dem kleinen Ende schnippen, um die Flüssigkeit in Richtung der Kappe zu bewegen.
2. Schneide mit einer Rasierklinge das kleine Ende der Spitze ab und lege sie über ein Röhrchen mit geringer Proteinbindung. (Vermeiden Sie die Verwendung von Styroporröhren, da der TiO₂ an den Seiten der Röhre haften bleibt.) Entfernen Sie die Kappe und führen Sie eine Mikropipette ein, um den restlichen ACN herauszustechen. Wiederholen Sie die Wäsche mit 200 μl 100 % ACN. Die TiO2-Kügelchen befinden sich nun für die folgenden Schritte in der Röhre mit geringer Proteinbindung.
3. TiO₂ mit 500 μl 100% ACN 2x vorkonditionieren. Pipettieren Sie es, um die Kügelchen mit dem Lösungsmittel zu vermischen. Zentrifugieren Sie sie bei 100 x g für 1 min.
4. TiO₂ mit 500 μL 0,2 M Natriumphosphatpuffer (pH ~7) 2x konditionieren. Die Kügelchen 3x mit 300 μL Äquilibrierungspuffer waschen. Da TiO₂ sehr dicht ist, setzen sich die Kügelchen schnell ab.
Geben Sie 400 μl 50 % ACN, 0,1 % TFA in das Röhrchen mit geringer Proteinbindung, gefolgt von der Zugabe von 84 μl Milchsäure. Übertragen Sie die resuspendierten Phosphopeptide in das Röhrchen mit geringer Proteinbindung und inkubieren Sie sie 1 h lang bei Raumtemperatur mit einem durchgehenden Rotator.
Zentrifugieren Sie die Kügelchen bei 100 x g für 1 min, um sie zu pelletieren. Waschen Sie sie 2x mit 300 μl Äquilibrierungspuffer (Tabelle 1) und schleudern Sie sie 1 min lang bei 100 x g herunter.
Spülen Sie die Kügelchen 2x mit 300 μl Spülpuffer und geben Sie sie in einen 0,2 μm Schleuderfilter. Bei 1.500 x g für 1 min drehen.
Füllen Sie die Filtereinheit in ein sauberes 1,5-ml-Röhrchen mit geringer Proteinbindung. Eluieren Sie den Inhalt 2x mit 200 μL 0,9% NH₃ in H₂O. Messen Sie den pH-Wert mit pH-Streifen, der zwischen 10 und 11 liegen sollte. Konzentrieren Sie das Eluat vakuum, um es über Nacht zu trocknen und das Ammoniak zu verdampfen.

Tabelle 1: Puffer und Lösungen.Diese Tabelle zeigt die Zusammensetzung der Puffer und Lösungen, die in diesem Protokoll verwendet werden.

Puffer	Volumen	Zusammensetzung
6 M Guanidiniumchlorid-Lysepuffer	50 mL	6 M Guanidiniumchlorid, 100 mM Tris pH 8,5, 10 mM Tris (2-Carboxyethyl) Phosphin, 40 mM Chloracetamid, 2 mM Natriumorthovanadat, 2,5 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM β-Glycerophosphat, 500 mg n-Octylglykosid, Reinstwasser pro Volumen
100 mM Natriumpyrophosphat	50 mL	2,23 g Natriumpyrophosphat-Decahydrat, Reinstwasser pro Volumen
1M β-Glycerophosphat	50 mL	15,31 g β-Glycerophosphat, Reinstwasser pro Volumen
5% Trifluoressigsäure	20 mL	1 mL 100%ige Trifluoressigsäure in 19 mL Reinstwasser geben
0,1 % Trifluoressigsäure	250 mL	Geben Sie 5 mL 5%ige Trifluoressigsäure in 245 mL Reinstwasser
pY-Elutionspuffer	250 mL	0,1 % Trifluoressigsäure, 40 % Acetonitril, Reinstwasser pro Volumen
pST-Elutionspuffer	250 mL	0,1 % Trifluoressigsäure, 50 % Acetonitril, Reinstwasser pro Volumen
IP-Bindungspuffer	200 mL	50 mM Tris pH 7,4, 50 mM Natriumchlorid, Reinstwasser pro Volumen
25 mM Ammoniumbicarbonat, pH 7,5	10 mL	19,7 mg in 10 mL sterilem Reinstwasser mit einem pH-Wert von 7,5 und 1 N Salzsäure (~10-15 μL/10 ml Lösung) auflösen, frisch machen
1M Phosphatpuffer, pH 7	1.000 mL	423 mL 1 M Natriumdihydrogenphosphat, 577 mL 1 M Natriumhydrogenphosphat
Äquilibrierungspuffer	14 mL	6,3 mL Acetonitril, 280 μL 5% Trifluoressigsäure, 1740 μL Milchsäure, 5,68 mL Reinstwasser
Puffer zum Spülen	20 mL	9 mL Acetonitril, 400 μL 5 % Trifluoressigsäure, 10,6 mL Reinstwasser
Lösung für die Massenspektrometrie	10 mL	500 μl Acetonitril, 200 μl 5%ige Trifluoressigsäure, 9,3 mL Reinstwasser
Puffer A	250 mL	5 mM Monokaliumphosphat (pH 2,65), 30 % Acetonitril, 5 mM Kaliumchlorid, Reinstwasser pro Volumen
Puffer B	250 mL	5 mM Monokaliumphosphat (pH 2,65), 30 % Acetonitril, 350 mM Kaliumchlorid, Reinstwasser pro Volumen
0,9 % Ammoniumhydroxid	10 mL	300 μL 29,42 % Ammoniumhydroxid, 9,7 mL Reinstwasser

Disclosures

No conflicts of interest declared.

Materials

Vakuum-Verteiler	Restek	Artikel-Nr.: 26080
Lyophilisierer	Labconco	7420020
CentriVap Tisch-Vakuumkonzentrator	Labconco	7810010
Ende-über-Ende-Rotator	ThermoFisher Scientific	Artikel-Nr.: 415110Q
Rasierklinge	Fisher Scientific	620177
Amicon Ultra-15 Zentrifugalfiltereinheiten	Millipore Sigma	UFC901024
Nunc 15 mL konische Röhrchen	ThermoFisher Scientific	Tel.: 12-565-268
Millipore 0,2 μm Spin-Filter	Millipore Sigma	UFC30GVNB
Eppendorf-Röhrchen mit geringer Proteinbindung	Eppendorf	22431081
Anti-Phosphotyrosin, Agarose, Klon: 4G10	Millipore Sigma	Nr. 16101
Peptid-Assay-Kit	Thermo Scientific	Artikel-Nr.: 23275
Trifluoressigsäure (TFA)	Fisher Scientific	PI-28904
Acetonitril (ACN)	Fisher Scientific	Nr. A21-1
Milchsäure	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 69785-250ML
Ammoniakwasser	Fisher Scientific	Nr. A669S-500
Kaliumphosphat monobasisch	Fisher Scientific	Nr. BP362-500
Kaliumchlorid	Fisher Scientific	Nr. BP366-500
Calciumchlorid-Dihydrat	Fisher Scientific	BP510-500
Tris Basis	Fisher Scientific	Nr. BP152-5
MonoTip	PolyLC Inc	TT200TIO,96

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