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Titandioxid-basierte Anreicherung von Phosphopeptiden: Ein Verfahren zur selektiven Isolierung von Phosphopeptiden aus der Peptidbibliothek

April 30th, 2023

In This Article

Abstract

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Quelle: Cheng, L. C. et al. Phosphopeptid-Anreicherung gekoppelt mit markierungsfreier quantitativer Massenspektrometrie zur Untersuchung des Phosphoproteoms bei Prostatakrebs. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video zeigt die Titandioxid-basierte Anreicherung von Phosphopeptiden, die aus Prostatatumorgewebe extrahiert wurden. Diese angereicherten Phosphopeptide können für nachgelagerte Anwendungen wie die Proteincharakterisierung verwendet werden, um die zellulären Signalwege zu verstehen, die an der Progression von Prostatakrebs beteiligt sind.

Protocol

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>1. Titandioxid-Anreicherung von pY-Peptiden

  1. Resuspendieren Sie die ausgetrockneten Phosphopeptide in 200 μl 50 % ACN, 0,1 % TFA. Vortexen und zentrifugieren Sie sie bei 10.000 x g für 30 s. Wiederholen Sie dies 1x, um sie gut zu resuspendieren.
  2. Vorbereitung der TiO 2-Kügelchen, die in Spitzen enthalten sind, die eine Kapazität von 200 μl Proben haben.
    1. Tippen Sie vorsichtig auf die kleine Spitze der Spitze, um das Material zu diesem Ende zu bewegen. Spülen Sie die Spitze aus, indem Sie 200 μl 100 % ACN hinzufügen, dann die Spitze umdrehen und mit dem kleinen Ende schnippen, um die Flüssigkeit in Richtung der Kappe zu bewegen.
    2. Schneide mit einer Rasierklinge das kleine Ende der Spitze ab und lege sie über ein Röhrchen mit geringer Proteinbindung. (Vermeiden Sie die Verwendung von Styroporröhren, da der TiO2 an den Seiten der Röhre haften bleibt.) Entfernen Sie die Kappe und führen Sie eine Mikropipette ein, um den restlichen ACN herauszustechen. Wiederholen Sie die Wäsche mit 200 μl 100 % ACN. Die TiO2-Kügelchen befinden sich nun für die folgenden Schritte in der Röhre mit geringer Proteinbindung.
    3. TiO2 mit 500 μl 100% ACN 2x vorkonditionieren. Pipettieren Sie es, um die Kügelchen mit dem Lösungsmittel zu vermischen. Zentrifugieren Sie sie bei 100 x g für 1 min.
    4. TiO2 mit 500 μL 0,2 M Natriumphosphatpuffer (pH ~7) 2x konditionieren. Die Kügelchen 3x mit 300 μL Äquilibrierungspuffer waschen. Da TiO2 sehr dicht ist, setzen sich die Kügelchen schnell ab.
  3. Geben Sie 400 μl 50 % ACN, 0,1 % TFA in das Röhrchen mit geringer Proteinbindung, gefolgt von der Zugabe von 84 μl Milchsäure. Übertragen Sie die resuspendierten Phosphopeptide in das Röhrchen mit geringer Proteinbindung und inkubieren Sie sie 1 h lang bei Raumtemperatur mit einem durchgehenden Rotator.
  4. Zentrifugieren Sie die Kügelchen bei 100 x g für 1 min, um sie zu pelletieren. Waschen Sie sie 2x mit 300 μl Äquilibrierungspuffer (Tabelle 1) und schleudern Sie sie 1 min lang bei 100 x g herunter.
  5. Spülen Sie die Kügelchen 2x mit 300 μl Spülpuffer und geben Sie sie in einen 0,2 μm Schleuderfilter. Bei 1.500 x g für 1 min drehen.
  6. Füllen Sie die Filtereinheit in ein sauberes 1,5-ml-Röhrchen mit geringer Proteinbindung. Eluieren Sie den Inhalt 2x mit 200 μL 0,9% NH₃ in H₂O. Messen Sie den pH-Wert mit pH-Streifen, der zwischen 10 und 11 liegen sollte. Konzentrieren Sie das Eluat vakuum, um es über Nacht zu trocknen und das Ammoniak zu verdampfen.

Tabelle 1: Puffer und Lösungen.Diese Tabelle zeigt die Zusammensetzung der Puffer und Lösungen, die in diesem Protokoll verwendet werden.

PufferVolumenZusammensetzung
6 M Guanidiniumchlorid-Lysepuffer50 mL6 M Guanidiniumchlorid, 100 mM Tris pH 8,5, 10 mM Tris (2-Carboxyethyl) Phosphin, 40 mM Chloracetamid, 2 mM Natriumorthovanadat, 2,5 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM β-Glycerophosphat, 500 mg n-Octylglykosid, Reinstwasser pro Volumen
100 mM Natriumpyrophosphat50 mL2,23 g Natriumpyrophosphat-Decahydrat, Reinstwasser pro Volumen
1M β-Glycerophosphat50 mL15,31 g β-Glycerophosphat, Reinstwasser pro Volumen
5% Trifluoressigsäure20 mL1 mL 100%ige Trifluoressigsäure in 19 mL Reinstwasser geben
0,1 % Trifluoressigsäure250 mLGeben Sie 5 mL 5%ige Trifluoressigsäure in 245 mL Reinstwasser
pY-Elutionspuffer250 mL0,1 % Trifluoressigsäure, 40 % Acetonitril, Reinstwasser pro Volumen
pST-Elutionspuffer250 mL0,1 % Trifluoressigsäure, 50 % Acetonitril, Reinstwasser pro Volumen
IP-Bindungspuffer200 mL50 mM Tris pH 7,4, 50 mM Natriumchlorid, Reinstwasser pro Volumen
25 mM Ammoniumbicarbonat, pH 7,510 mL19,7 mg in 10 mL sterilem Reinstwasser mit einem pH-Wert von 7,5 und 1 N Salzsäure (~10-15 μL/10 ml Lösung) auflösen, frisch machen
1M Phosphatpuffer, pH 71.000 mL423 mL 1 M Natriumdihydrogenphosphat, 577 mL 1 M Natriumhydrogenphosphat
Äquilibrierungspuffer14 mL6,3 mL Acetonitril, 280 μL 5% Trifluoressigsäure, 1740 μL Milchsäure, 5,68 mL Reinstwasser
Puffer zum Spülen20 mL9 mL Acetonitril, 400 μL 5 % Trifluoressigsäure, 10,6 mL Reinstwasser
Lösung für die Massenspektrometrie10 mL500 μl Acetonitril, 200 μl 5%ige Trifluoressigsäure, 9,3 mL Reinstwasser
Puffer A250 mL5 mM Monokaliumphosphat (pH 2,65), 30 % Acetonitril, 5 mM Kaliumchlorid, Reinstwasser pro Volumen
Puffer B250 mL5 mM Monokaliumphosphat (pH 2,65), 30 % Acetonitril, 350 mM Kaliumchlorid, Reinstwasser pro Volumen
0,9 % Ammoniumhydroxid10 mL300 μL 29,42 % Ammoniumhydroxid, 9,7 mL Reinstwasser

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Disclosures

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Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Vakuum-VerteilerRestekArtikel-Nr.: 26080
LyophilisiererLabconco7420020
CentriVap Tisch-VakuumkonzentratorLabconco7810010
Ende-über-Ende-RotatorThermoFisher ScientificArtikel-Nr.: 415110Q
RasierklingeFisher Scientific620177
Amicon Ultra-15 ZentrifugalfiltereinheitenMillipore SigmaUFC901024
Nunc 15 mL konische RöhrchenThermoFisher ScientificTel.: 12-565-268
Millipore 0,2 μm Spin-FilterMillipore SigmaUFC30GVNB
Eppendorf-Röhrchen mit geringer ProteinbindungEppendorf22431081
Anti-Phosphotyrosin, Agarose, Klon: 4G10Millipore SigmaNr. 16101
Peptid-Assay-KitThermo ScientificArtikel-Nr.: 23275
Trifluoressigsäure (TFA)Fisher ScientificPI-28904
Acetonitril (ACN)Fisher ScientificNr. A21-1
MilchsäureSigma-AldrichArtikel-Nr.: 69785-250ML
AmmoniakwasserFisher ScientificNr. A669S-500
Kaliumphosphat monobasischFisher ScientificNr. BP362-500
KaliumchloridFisher ScientificNr. BP366-500
Calciumchlorid-DihydratFisher ScientificBP510-500
Tris BasisFisher ScientificNr. BP152-5
MonoTipPolyLC IncTT200TIO,96

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Titanium DioxidePhosphopeptide EnrichmentPeptide LibraryBinding BufferCentrifugationSpin FilterAmmonia ElutionPhosphopeptide IsolationProstate CancerMass Spectrometry

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