Modellierung von Prostatakrebs in gentechnisch veränderten Mausmodellen: Eine CRISPR/Cas9-vermittelte lokalisierte Gen-Editing-Technik in vorderen Prostatalappenzellen der Maus

Abstract

Quelle: Riedel, M. et al. Virusabgabe von CRISPR-Leitfäden zur Genveränderung an die Prostata der Maus. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video beschreibt eine Methode zur Bearbeitung spezifischer Gene in Prostatazellen mit Hilfe eines Adenovirus-basierten Verabreichungssystems. Der Ansatz ermöglicht eine orthotope und lokalisierte Veränderung der Genexpression unter Verwendung der CRISPR-Technologie, um neuartige Mausmodelle für Prostatakrebs zu entwickeln.

Protocol

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Virusabgabe an die Prostata der Maus

1. Betäuben Sie das Tier durch intraperitoneale Injektion mit einer sterilen 1-ml-Spritze und einer 27G x 1/2" Nadel. Verwenden Sie eine Anästhesiedosis von 0,01 ml/g Körpergewicht. Wenn der Eingriff länger als 30 Minuten dauert, halten Sie die Narkose aufrecht, indem Sie alle 30 Minuten 1/3 der Anfangsdosis injizieren.
2. Untersuchen Sie die Anästhesietiefe, indem Sie die Muskelentspannung, den Pedalrückzug und die Lidreflexe beurteilen. Wenn ein Verlust der Reflexe beobachtet wird, rasieren Sie den Unterbauch des Tieres.
3. Decken Sie die Augen des Tieres vorsichtig mit tierärztlicher Augensalbe und einem sterilen Wattestäbchen ab, um eine Erblindung aufgrund fehlender Hornhautreflexe zu verhindern.
4. Wischen Sie den rasierten Bauch mit 70 % Ethanol und 10 % Povidon-Jod ab, um den Operationsbereich zu desinfizieren. Schrubben Sie den Operationsbereich von der Mitte des Operationsbereichs zur Peripherie.
5. Führen Sie mit einer sterilen chirurgischen Schere einen vertikalen Hautschnitt an der unteren Bauchmittellinie von ca. 1 cm durch.
6. Heben Sie das Bauchfell mit einer feinen Pinzette an, um eine Beschädigung der darunter liegenden Organe zu vermeiden. Machen Sie vorsichtig einen Schnitt von <8 mm mit einer chirurgischen Schere durch das Bauchfell.
   HINWEIS: Im Gegensatz zum Menschen besteht die Prostata eines Nagetiers aus vier separaten Lappen. Der Frontlappen ist an der Samenblase befestigt.
7. Bewegen Sie das Fettgewebe vorsichtig zur Seite, um die Samenblase freizulegen. Heben Sie die Samenblase vorsichtig mit einer Ringzange an, bis die vordere Prostata zu erkennen ist (Abbildung 1).
8. Injizieren Sie ein Gesamtvolumen von 30 μl Viruslösung (3 x 10¹⁰ Viruspartikel) in das vordere Prostataepithel mit einer 0,5 ml Insulinspritze und einer 30G x 8 mm Nadel. Minimieren Sie Leckagen und stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeit im Gewebe absorbiert wird und eine kleine Blase bildet. Legen Sie die Samenblase wieder in die Bauchhöhle ein.
9. Nähen Sie das Peritoneum mit 2-3 einfachen unterbrochenen Stichen mit 6-0 resorbierbaren Nähten mit einem 13 mm, 3/8 Kreis und einer spitz zulaufenden Nadel.
10. Heften Sie die Haut mit drei sterilen 4,8 x 6,5 mm Clips ab und heben Sie die Haut mit einer Pinzette an, um eine Beschädigung des Bauchfells zu vermeiden.
11. Für eine bessere Genesung wenden Sie das Anästhesie-Gegenmittel in einer Dosis von 0,01 ml/g Körpergewicht durch intraperitoneale Injektion mit einer sterilen 1 ml-Spritze und einer 27 G x 1/2" Nadel an. Setzen Sie das Tier vorsichtig wieder in seinen Käfig ein.

Results

Abbildung 1: Illustration des Vorgehens. Das Verfahren wird an der Rosa26-LSL-Cas9-EGFP-Maus durchgeführt, die von Platt et al. erzeugt wurde. Die vordere Prostata (AP) ist an der Samenblase (SV) befestigt. Viruspartikel, die Guide-RNA und ein Cre-Protein exprimieren, werden in die vordere Prostata injiziert, um die Genexpression zu verändern.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B6J.129(B6N)-GT(ROSA)26Sor^{tm1(CAG-cas9*,-} ^{EGFP)Fezh} /J Mäuse	Das Jackson-Labor	Artikel-Nr.: 26175
0,5 ml U-100 Insulinspritze	Bd	324825	zur Virusinjektion
1 ml Spritze	Bd	300013	für Anästhesie-Injektion
30 G 1/2'' Nadel	Bd	Artikel-Nr.: 304000	für Anästhesie-Injektion
6-0 Polysorb Naht	Medtronic	GL889	das Bauchfell zu schließen
Sterilisiertes Einweg-OP-Tuch	mehrere Lieferanten
heizkissen	mehrere Lieferanten
Povidon-Jod-Vorbereitungspad	Fisher Scientific	Tel.: 06-669-70
Entgratmaschine	Äskulap	GT415	den Bauch rasieren
Dumont Pinzette	F.S.T	Tel.: 11252-00
Halsey Micro Nadelhalter	F.S.T	Nr. 12500-12
Iris-Schere	F.S.T	Nr. 14094-11
Pinzette mit schmalem Muster	F.S.T	Nr. 11002-12
Ringzange	F.S.T	Artikel-Nr.: 11106-09
Wound Clip System Griff inkl. Clips	F.S.T	Artikel-Nr.: 12030-01	um die Haut zu schließen
Wundclip-System-Entferner	F.S.T	Nr. 12030-04
1x PBS	Gibco	Nr. 10010-023
Antisedan			aus der Tierhaltung
Butorphanol			aus der Tierhaltung
Medetomidinhydrochlorid			aus der Tierhaltung
Midazolam			aus der Tierhaltung
100% Ethanol	Fisher Scientific	Tel.: 22-032-103
Augensalbe	Takeda	7242
Viren (AAV, AV)	mehrere Lieferanten		Der in diesem Protokoll verwendete Virus ist eine Eigenproduktion