Isolierung von metastasierten Krebszellkolonien aus Hühner-CAM: Ein Verfahren zur Isolierung von Krebszellen aus schalenlosen Eikulturen

Zusammenfassung

Quelle: Stoletov, K. et al. Entdeckung metastasierender Regulatoren unter Verwendung eines schnellen und quantitativen chorioallantoischen Membranmodells für intravitale Küken. J. Vis. Exp. (2021)

In diesem Video beschreiben wir die Isolierung von metastasierenden Krebszellkolonien aus der Chorioallantoismembran (CAM) des Huhns mit Hilfe einer schalenlosen Eikultur. Diese Methode hilft bei der Suche nach Faktoren, die für die Metastasierung von Krebs verantwortlich sein könnten.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Isolierung metastasierender Kolonien

1. Am 5. Tag nach der Injektion nehmen Sie die Embryonen aus dem Inkubator und untersuchen Sie die CAMs des Embryos auf die Verteilung der metastasierenden Kolonie. Identifizieren Sie die Embryonen mit gleichmäßiger Kolonieverteilung, in denen kompakte (oder übermäßig invasive) Kolonien vorhanden sind.
   Anmerkung: Der Prozess der Kultivierung von Hühnerembryonen ist nicht steril, daher müssen alle Screening-Schritte unter hochreinen Bedingungen durchgeführt werden, um eine zukünftige Kontamination der Gewebekultur zu vermeiden. Eine Kontamination ist recht selten und kann leicht vermieden werden, indem man Handschuhe und eine Maske trägt und während der Zellinjektion und der Isolierung von Kolonien nur sterile Werkzeuge verwendet. Es wird empfohlen, die Embryonen einzeln zu untersuchen, um ihre Exposition gegenüber der Umgebungstemperatur des Labors zu verringern und eine Kontamination zu vermeiden.
2. Lokalisieren Sie die metastasierende Kolonie, die Sie interessiert. Eine kompakte Kolonie kann als eine Kolonie beschrieben werden, bei der sich die meisten Krebszellen in einem begrenzten Bereich im CAM-Gewebe befinden (die Zellen erscheinen "verklumpt"). Eine invasive Kolonie kann als eine Kolonie beschrieben werden, in der Krebszellen im CAM-Gewebe "zerstreut" sind (Abbildung 1A, B).
   HINWEIS: Die "Kompaktheit" der metastasierenden Kolonie kann entweder durch die Hemmung der Invasion von Krebszellen, die Hemmung der Proliferation von Krebszellen oder beides erklärt werden. Alle Szenarien sollten berücksichtigt werden, und Kontaktkolonien sollten isoliert werden (Abbildung 1A, B). Ein einfaches Fluoreszenz-Stereomikroskop kann verwendet werden, um zwischen kompakten und invasiven metastasierten Kolonie-Phänotypen zu unterscheiden.
3. Ziehen Sie unter dem Dissektionsmikroskop das CAM-Gewebe, das die metastasierende Kolonie von Interesse enthält, vorsichtig mit einer feinen Pinzette nach oben (Abbildung 1C).
4. Schneiden Sie das CAM-Gewebe, das die metastasierende Kolonie enthält, mit einer chirurgischen Schere ab.
5. Übertragen Sie das CAM-Gewebe, das die metastasierende Kolonie enthält, in ein leeres, steriles 1,5-ml-Röhrchen (auf Eis) und schließen Sie den Röhrchendeckel.
   Anmerkung: Isolierte Kolonien können bis zu 3 Stunden auf Eis gehalten werden, ohne dass die Lebensfähigkeit verloren geht.
6. Wiederholen Sie den Exzisionsvorgang, bis alle interessierenden Kolonien in separaten Röhrchen gesammelt sind. Um Tierleid zu vermeiden, sollten Sie nicht mehr als 2-3 Bienenvölker aus einem Embryo herausschneiden. Euthanasieren Sie die Embryonen durch Einfrieren bei -20 °C (oder eine andere zugelassene Methode) unmittelbar nach der Kolonexzision.
7. Zerkleinern Sie das CAM-Gewebe vorsichtig in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit einer sterilen 18G-Nadel. Verwende für jedes Volk eine separate Nadel.
8. 100 μl 1x Kollagenaselösung zugeben und 30 min bei 37 °C inkubieren.
9. Schleudern Sie die Zellen und das CAM-Gewebe bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur herunter.
10. Aspirieren Sie die Kollagenaselösung und resuspendieren Sie die Zellen in einem vollständigen Medium, das für die gewünschte Zelllinie verwendet wird.
    Anmerkung: Normalerweise ist CAM-Gewebe nach einer Kollagenase-Behandlung nicht vollständig dissoziiert, und Krebszellen vermehren sich zuerst in den CAM-Gewebestücken und wandern erst später in die Gewebekulturschale.
11. Schleudern Sie die Zellen und das CAM-Gewebe erneut bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
12. Resuspendieren Sie Zellen und CAM-Gewebestücke in 1 ml vollständigem Medium plus Selektionsfaktor (falls vorhanden) und überführen Sie sie dann in eine einzelne 12-Well-Gewebekulturschale.
    Anmerkung: Hühner-CAM-Fibroblasten können in Gewebekulturen über mehrere Passagen persistieren und die klonale Expansion hemmen. Die Fähigkeit, die metastasierenden Kolonien in Gegenwart eines Selektionsfaktors zu erweitern (d.h. wenn ein Vektor, der verwendet wurde, um Krebszellen fluoreszierend zu machen, auch ein Antibiotikaresistenzgen von Säugetieren kodiert) kann die klonale Expansion erheblich beschleunigen. Vor dem Screening sollte ein Kill-Curve-Experiment durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die richtige Konzentration von Antibiotika verwendet wird.
13. Überwachen Sie die Krebszellen in den nächsten 1-3 Wochen täglich auf Wachstum und Kontamination.
14. Wenn die Zellen 70–80 % der Konfluenz erreichen, werden die Zellen in eine Kulturschale mit größerem Volumen überführt.
    Anmerkung: Es wird empfohlen, die Zellen so lange zu erweitern, bis mindestens zwei kryogene Fläschchen jedes Klons eingefroren werden können. Die Aufbewahrung großer Mengen an Gewebekulturen kann mühsam und unnötig sein.
15. Fahren Sie mit der Sequenzierung oder der nächsten Auswahlrunde fort, sobald genügend Krebszellzahlen erreicht sind. Im Allgemeinen sind 1 x 10⁶ der Krebszellen für moderne Hochdurchsatz-Sequenzierungstechniken ausreichend.
16. Fahren Sie mit der Klonreinjektion und der Bildgebung und Quantifizierung der Kompaktheit der Kolonie oder des Kontakts von Krebszellen und Blutgefäßen fort (Abbildung 2A). Alternativ können Sie mit der Hochdurchsatz-Sequenzierung fortfahren oder die Kolonieauswahl wiederholen.
    HINWEIS: Um die Anzahl der falsch positiven Ergebnisse zu verringern, werden mindestens zwei Auswahlrunden empfohlen. Zwei Ansätze wurden erfolgreich angewandt. 1) Expandieren Sie jeden Klon und injizieren Sie ihn einzeln erneut, um den Phänotyp der Kolonie zu bestätigen. 2) Mischen Sie alle expandierten Klone im Verhältnis 1:1, fügen Sie sie als Mischung erneut hinzu und wiederholen Sie den Auswahlzyklus.

Ergebnisse

Abbildung 1. Repräsentative Ergebnisse für verschiedene Schritte des Screening-Protokolls.(A) Metastasierende Kolonien, die von heterogenen (Bibliothek transduzierten Krebszelllinien HEp3-Zellen) gebildet werden, 5 Tage nach der Injektion. Der rote Pfeil zeigt eine kompakte Kolonie (potentiell positiver Treffer), die herausgeschnitten werden sollte. (B...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Konische Zentrifugenröhrchen mit 15 mL.	Corning	CLS430791-500EA
18 Gauge x 1 1/2 BD precision Nadel	Bd	BD305196	Wir verwenden 1,2 mm x 40 mm, es ist möglich bei Bedarf kürzere Nadeln zu verwenden
Tischzentrifuge.	Viele Quellen stehen zur Verfügung		Jede TC-kompatible Zentrifuge, die Kann zum Schleudern der Zellen verwendet werden is geeignet
Kollagenase	Sigma	Nr. C0130-100MG
Wattestäbchen	Viele Quellen stehen zur Verfügung		Muss vor Gebrauch sterilisiert werden
Für die Zelle geeignete Nährmedien Verwendete Zeilen	Viele Quellen stehen zur Verfügung		Wir züchten HT1080, HEp3 und b16 cell Zeilen in DMEM, 10% FBS-Medien
Brutkasten für Eier	Viele Quellen stehen zur Verfügung		Ein exaktes Modell, das notwendig ist Hängt von der Größe des Bildschirms ab. Verfügbare Quellen sind MGF Company Inc., Savannah, GA, oder Lyon Electric Unternehmen Inc., Chula Vista, Kalifornien
Eppendor Tuben , 1,5ml	Sigma	T4816-250EA
Befruchtete weiße Leghorn-Eier	jeder lokale Zulieferant
feine Pinzette	Viele Quellen stehen zur Verfügung		Muss vor Gebrauch sterilisiert werden
Bildanalyse-Software			Wir verwenden Nikon Elements
PBS (1x)	Viele Quellen stehen zur Verfügung
Gewichtungsschalen aus Kunststoff	Simport	CA11006-614	Die Abmessungen betragen 78x78x25mm; Viele Andere Quellen sind verfügbar
kleine chirurgische Schere	Viele Quellen stehen zur Verfügung		Muss vor Gebrauch sterilisiert werden
Stereo-Fluoreszenzmikroskop			Wir verwenden Zeiss Lumar v12