Isolierung und Kultivierung von murinen Zungenepithelzellen: Ein Verfahren zur Isolierung und Kultivierung von Zungenepithelzellen aus einem Mausmodell

Zusammenfassung

Quelle: Prasad, M. et al. In vitro Etablierung einer gentechnisch veränderten Maus-Zelllinie für Kopf- und Halskrebs unter Verwendung eines Adeno-assoziierten Virus-Cas9-Systems. J. Vis. Exp. (2020)

In diesem Video beschreiben wir die Isolierung von Epithelzellen aus einer Mauszunge. Diese Zellen können weiter kultiviert werden, um Zellkolonien zu bilden.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Isolierung und Kultivierung von Primärzellen

1. Euthanasieren eines 6 Wochen alten männlichen oder weiblichen B6; 129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J durch CO₂-Erstickung oder ein anderes von der IACUC zugelassenes Protokoll.
   Anmerkung: Diese CRISPR/Cas9-Knockin-Mäuse haben eine Cre-rekombinaseabhängige Expression von cas9-Endonuklease und EGFP, die von einem CAG-Promotor geleitet wird. Die im Genom dieser Mäuse vorhandene Upstream-Lox-Stop-Lox (LSL)-Sequenz verhindert die Expression von Cas9 und EGFP in Abwesenheit von Cre-Rekombinase. In Kombination mit einzelnen Guide-RNAs (sgRNAs) und einer Cre-Quelle ermöglichen sie die Editierung einzelner oder mehrerer Mausgene in vivo oder ex vivo.
2. Sezieren Sie die Zunge der eingeschläferten Mäuse mit einer chirurgischen Schere.
3. Dissoziieren Sie das Gewebe manuell, indem Sie das Zungengewebe mit einem Skalpell in sehr kleine Fragmente zerkleinern. Sammeln Sie die Gewebefragmente in einem 15-ml-Röhrchen mit 4,5 ml RPMI-Normalmedium (ohne Serum).
4. Geben Sie den Dreifach-Enzymmix (200 μL) (Rezeptur siehe Tabelle 1) zu den Gewebefragmenten.
5. Inkubieren Sie das Gewebe-Enzym-Gemisch 30 Minuten lang bei 37 °C und klopfen Sie alle 10 Minuten auf das Röhrchen, um die enzymatische Dissoziation des Gewebes zu verbessern.
6. Geben Sie 5 % fötales Rinderserum (FBS), das HBSS/PBS enthält, zum Gewebe-Enzym-Gemisch, um die Enzymwirkung zu stoppen.
7. Filtrieren Sie die obige Zellsuspension durch ein steriles 70 μm Nylonnetz, um die dispergierten Zellen und größere Gewebefragmente zu trennen.
8. Die filtrierte Zellsuspension wird durch Zentrifugation für 300 x g für 5 min in HBSS/PBS bei RT gewaschen
.
9. Resuspendieren Sie das Pellet in Kulturmedium (10 % FBS in RPMI/DMEM) und züchten Sie es in 60-mm-Kulturschalen, bis sich unterschiedliche Zellkolonien gebildet haben.
   1. Die Kulturzellaggregate werden auf dem Filter in einer 60-mm-Kulturschale mit 3 ml vollständigem Medium (10 % FBS in RPMI/DMEM) aufbewahrt, bis Zellkolonien gebildet werden.
10. Untersuchen Sie die Primärzellen mikroskopisch auf das Vorhandensein einer Fibroblastenkontamination nach 1 Woche Kultur. Die aus Aggregaten und Zellsuspensionen entwickelten Primärzellen werden 1 min lang mit 0,25 Trypsin, 0,02 % EDTA-Lösung, bei 37 °C behandelt, um Fibroblasten zu entfernen
    Anmerkung: In der Regel produziert die Primärkultur aus Zellaggregaten mehr Kolonien als Einzelzellsuspensionen. Die Zellen aus diesen Kolonien bieten eine bessere Transduktionseffizienz bei der AAV-Transduktion.

10X Dreifach-Enzym-Stammlösung:
Kollagenase	1 g Endkonzentration [10 mg/ml]
Hyaluronidase	100 mg [1 mg/ml]
DNase	20.000 Einheiten Endkonzentration [200 mg/ml]
PBS 1X	Stellen Sie bis zu 100 mL her

Tabelle 1: Rezeptur des in dieser Studie verwendeten Puffers

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Maus-Stämme
Nr. C57BL/6	Envigo
B6; 129-GT(ROSA)26Sortm1(CAGcas9*,-EGFP)Fezh/J	Jackson-Labore	Artikel-Nr.: 24857
nicken. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid)	Envigo
Enzyme
Benzonase	Sigma	Nr. E1014
Kollagenase IV	Thermo Fisher Scientific	17104019
DNAse	Thermo Fisher Scientific	18047019
Hyaluronidase	MilliporeSigma	Nr. H3506
Trypsin	Biological Industries Israel BeitHaemek Ltd.	03-050-1B
Nährmedien, Chemikalien und Reagenzien
Bsa	Amresco	0332-TAM-50G
DMEM	Biological Industries Israel BeitHaemek Ltd.	01-055-1A
FBS	Biological Industries Israel BeitHaemek Ltd.	04-127-1A
HBSS	Sigma	Nr. H6648
Pbs	Biological Industries Israel BeitHaemek Ltd.	02-023-1A
Tris-Puffer	MERCK Millipore	Artikel-Nr.: 648311-1KG
Waren aus Kunststoff
Amicon-ULTRA Filter 100 KDa	Millipore	UFC910024
0,22 μm Sterilfilter, 4 mm	Millex	SLGV004SL
0,45 μm Sterilfilter, 13 mm	Millex	SLHV013SL
Kulturplatten	Greiner Bio-One
Falken-Röhren	Greiner Bio-One