FFPE-Gewebevorbehandlung für RNA CISH: Ein Verfahren zur Verarbeitung von Formalin-fixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten für die chromogene In-situ-Hybridisierung von RNA

Zusammenfassung

Quelle: Outh-Gauer, S. et al. Chromogene In-situ-Hybridisierung als Werkzeug für die HPV-bedingte Diagnose von Kopf- und Halskrebs. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video zeigt die Schritte bei der Vorbehandlung von FFPE-Gewebeproben für die chromogene RNA-In-situ-Hybridisierung. Der Vorbehandlungsprozess trägt dazu bei, die Integrität der Nukleinsäuren in den Zellen und die gesamte Gewebemorphologie zu erhalten.

Protokoll

Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für menschliches Wohlergehen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.

>1. Vorbereitung der Materialien

1. Herstellung von 1x Target Retrieval Reagenz
   1. Geben Sie in einem großen Becherglas 70 ml 10x Reagenz zur Zielgewinnung (siehe Materialtabelle) zu 630 mL destilliertem Wasser.
   2. Stellen Sie das Becherglas mit einem Magnetrührer auf eine Heizplatte. Decken Sie es mit Alufolie ab.
   3. Den Inhalt bei 100 °C 10–15 Min. kochen lassen
      HINWEIS: Nicht länger als 30 min kochen lassen.

>2. Vorbehandlung von Gewebe

HINWEIS: Diese Schritte folgen der "Standard"-Vorbehandlungsempfehlung gemäß den Anweisungen des Herstellers für Kopf- und Halsproben. Der Zeitplan der Abschnitte 2.1 und 2.2 muss je nach manipuliertem Gewebe möglicherweise angepasst werden.

1. Blockade der Peroxidase-Aktivität
   1. Geben Sie 4–6 Tropfen Wasserstoffperoxid (siehe Materialtabelle) zu jedem Objektträger und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.
   2. Waschen Sie die Objektträger 2x für 2 min in destilliertem Wasser bei Raumtemperatur.
2. Bruch von RNA/Gewebe-Bindungen
   1. Entfernen Sie mit einer Kralle die Alufolie von dem siedenden 1x Target Retrieval Reagenz (TTR1x), das auf einer Heizplatte platziert ist, und hören Sie auf zu rühren. Tauchen Sie das Schiebegestell langsam und sehr vorsichtig 15 Minuten lang ein. Decken Sie den Becher wieder mit Alufolie ab.
      Anmerkung: Das Köcheln muss während dieses Schritts bestehen bleiben.
      Vorsicht: Verwenden Sie die Klaue, um die Aluminiumfolie und das Gleitgestell zu manipulieren, um Verbrennungen zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung wie Handschuhe und einen Laborkittel tragen.
   2. Schieben Sie den heißen Schieber sofort mit der Klaue in ein destilliertes Wasserbad und waschen Sie ihn 2 Min.
      Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass die Proben im TTR1x nicht abkühlen.
   3. Waschen Sie die Objektträger 2 Minuten lang in frischem 100% Ethanol.
   4. Lassen Sie die Objektträger 2 min bei Raumtemperatur trocknen.
3. Erstellung von Barrieren
   1. Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Barrierestift (siehe Materialtabelle) eine Barriere um die Probe. Mindestens 5 Min. trocknen lassen
      Anmerkung: Lassen Sie die Barriere wirklich austrocknen. Wenn es sich während des Eingriffs abnutzt, zögern Sie nicht, es erneut zu ziehen. Vermeiden Sie es, das Taschentuch mit dem Stift zu berühren. Das Protokoll kann hier über Nacht pausiert werden.
4. Protease-Verdauung
   1. Legen Sie die Objektträger auf das Objektträgergestell und fügen Sie ~4 Tropfen Protease Plus pro Probe hinzu (siehe Materialtabelle).
   2. Decken Sie die Feuchtigkeitskontrollschale mit einem Deckel ab und setzen Sie sie für 30 min bei 40 °C in den Hybridisierungsofen ein.
      Anmerkung: Um ein Verdampfen zu verhindern, stellen Sie sicher, dass der Drehknopf vollständig in die Verriegelungsposition gedreht ist.
   3. Nehmen Sie das Blech aus dem Ofen und entfernen Sie den Schieberost.
   4. Entfernen Sie einen Objektträger nach dem anderen, entfernen Sie schnell überschüssige Flüssigkeit und legen Sie den Objektträger in ein Objektträgergestell, das in eine mit destilliertem Wasser gefüllte Färbeschale getaucht ist.
   5. Waschen Sie die Objektträger 2x für 2 min in destilliertem Wasser bei Raumtemperatur. Ständig rühren.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
HybEZ Backofen (110 V)	Fortschrittliche Zelldiagnostik Inc.	Artikel-Nr.: 321710
HybEZ Schiebegestell	Fortschrittliche Zelldiagnostik Inc.	300104
ImmEdge Hydrophober Barrierestift	Fortschrittliche Zelldiagnostik Inc.	310018
RNAscope H202 & Protease Plus Reagenz	Fortschrittliche Zelldiagnostik Inc.	Artikel-Nr.: 322330	Wasserstoffperoxid x2 und Protease Plus x 1
RNAscope Target Retrieval Reagenzien	Fortschrittliche Zelldiagnostik Inc.	Artikel-Nr.: 322000