Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für menschliches Wohlergehen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.
>1. Ausführen des Assays
HINWEIS: Lassen Sie die Abschnitte zwischen den Inkubationsschritten nicht austrocknen.
- Hybridisierung der HPV-Sonde
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Sonden vor der Verwendung vorgewärmt werden, um eventuellen Niederschlag aufzulösen. Für diesen Schritt kann anstelle der HPV-Sonde auch die Peptidyl-Prolyl-Isomerase B (PPIB) für die Positivkontrolle oder die Dihydrodipicolinat-Reduktase (DAPB) für die Negativkontrolle (siehe Materialtabelle) verwendet werden.
- Tippen und/oder schnippen Sie auf die Objektträger, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und legen Sie sie in die Objektträgerablage. Fügen Sie ~4 Tropfen HPV-Sonde hinzu, um jeden Abschnitt vollständig abzudecken.
- Decken Sie das Blech mit einem Deckel ab und schieben Sie es für 2 h bei 40 °C in den Ofen.
HINWEIS: Um Verdunstung zu verhindern, stellen Sie sicher, dass der Drehknopf vollständig in die Verriegelungsposition gedreht ist.
- Nehmen Sie das Blech aus dem Ofen und entfernen Sie den Schieberost.
- Entfernen Sie einen Objektträger nach dem anderen, entfernen Sie schnell überschüssige Flüssigkeit und legen Sie den Objektträger in ein Objektträgergestell, das in eine mit 1x Waschpuffer gefüllte Färbeschale getaucht ist.
- Waschen Sie die Objektträger in 1x Waschpuffer für 2 min bei Raumtemperatur unter ständigem Rühren. Wiederholen Sie dies mit frischem 1x Waschpuffer.
- Hybridisierung von AMP1, AMP2, AMP3 und AMP4
HINWEIS: Diese Schritte umfassen die Hybridisierung im Hybridisierungsofen und AMP1–AMP4 aus dem gekauften Kit (siehe Materialtabelle).
- Tippen und/oder schnippen, um überschüssige Flüssigkeit von den Objektträgern zu entfernen und sie in die Objektträgerablage zu legen. Fügen Sie ~4 Tropfen AMP1 hinzu, um jeden Abschnitt vollständig abzudecken.
- Decken Sie das Blech mit einem Deckel ab und schieben Sie es für 30 min bei 40 °C in den Ofen.
- Nehmen Sie das Blech aus dem Ofen und entfernen Sie den Schieberost.
- Entfernen Sie einen Objektträger nach dem anderen, entfernen Sie schnell überschüssige Flüssigkeit und legen Sie den Objektträger in ein Objektträgergestell, das in eine mit 1x Waschpuffer gefüllte Färbeschale getaucht ist.
- Waschen Sie die Objektträger in 1x Waschpuffer für 2 min bei Raumtemperatur unter ständigem Rühren. Wiederholen Sie dies mit frischem 1x Waschpuffer.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.2.1–1.2.5, aber verwenden Sie ~4 Tropfen AMP2 anstelle von AMP1 und inkubieren Sie 15 Minuten bei 40 °C. Waschen Sie die Objektträger 2x für 2 Minuten, beide Male in frischem Waschpuffer.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.2.1–1.2.5, verwenden Sie jedoch ~4 Tropfen AMP3 anstelle von AMP1 und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 40 °C. Waschen Sie die Objektträger 2x für 2 Minuten, beide Male in frischem Waschpuffer.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.2.1–1.2.5, aber verwenden Sie ~4 Tropfen AMP4 anstelle von AMP1 und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei 40 °C. Waschen Sie die Objektträger 2x für 2 Minuten, beide Male in frischem Waschpuffer.
- Hybridisierung von AMP5 und AMP6
HINWEIS: Diese Schritte umfassen nicht die Hybridisierung im Ofen, sondern die Hybridisierung bei Raumtemperatur. AMP5 und AMP6 stammen aus dem gekauften Bausatz (siehe Materialtabelle).
- Tippen und/oder schnippen Sie auf die Objektträger, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und legen Sie sie in die Objektträgerablage. Fügen Sie ~4 Tropfen AMP5 hinzu, um jeden Abschnitt vollständig abzudecken.
- Decken Sie das Tablett mit einem Deckel ab und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie einen Objektträger nach dem anderen schnell überschüssige Flüssigkeit und legen Sie ihn in ein Objektträgergestell, das in eine mit 1x Waschpuffer gefüllte Färbeschale getaucht ist.
- Waschen Sie die Objektträger in 1x Waschpuffer für 2 min bei Raumtemperatur unter ständigem Rühren. Wiederholen Sie dies mit frischem 1x Waschpuffer.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.3.1–1.3.4, verwenden Sie jedoch ~4 Tropfen AMP6 anstelle von AMP5 und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Objektträger 2x für 2 Minuten, beide Male in frischem Waschpuffer.
