>1. Herstellung von Gegenfärbereagenzien
- Bereiten Sie 50% Hämatoxylin vor.
- Geben Sie in einem Abzug 100 ml Gills Hämatoxylin I (siehe Materialtabelle) zu 100 ml destilliertem Wasser in eine Färbeschale.
Anmerkung: Die 50%ige Hämatoxylin-Färbelösung kann bis zu 1 Woche lang wiederverwendet werden.
- Bereiten Sie 0,02 % (w/v) Ammoniakwasser (Bläureagenz) vor.
In - den Abzug 1,43 ml 1 N Ammoniumhydroxid zu 250 ml destilliertem Wasser in einem Messzylinder oder einem anderen Behälter geben. Versiegeln Sie den Zylinder mit Paraffinfolie. Mischen Sie den Inhalt gut für 3x–5x.
Anmerkung: Für die Assay-Quantifizierung ist es wichtig, Ammoniumhydroxid zu verwenden. Die Reagenzien können im Voraus vorbereitet werden. Stellen Sie sicher, dass alle Behälter abgedeckt bleiben.
>2. Signaldetektion mit 3,3'-Diaminobenzidin
VORSICHT: Diaminobenzidin (DAB) ist giftig. Befolgen Sie die entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen und Sicherheitsrichtlinien, wenn Sie diese Chemikalie entsorgen und handhaben.
- Mischen Sie gleiche Volumina von DAB-A und DAB-B (siehe Materialtabelle) in einem Röhrchen geeigneter Größe, indem Sie die gleiche Anzahl von Tropfen jeder Lösung abgeben. Stellen Sie ~120 μl DAB-Substrat pro Abschnitt her (~2 Tropfen jedes Reagenzes/insgesamt 4). 3x–5x gut mischen.
- Nehmen Sie jede Folie nacheinander aus dem Schiebegestell und klopfen und/oder schnippen, um die überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, bevor Sie sie in die Schiebeablage legen.
- Pipettieren Sie ~120 μl DAB auf jeden Gewebeschnitt. Stellen Sie sicher, dass die Abschnitte abgedeckt sind, und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.
- Entsorgen Sie das restliche DAB gemäß den örtlichen Vorschriften und legen Sie das Dia in ein Dia-Rack, das in eine mit Leitungswasser gefüllte Färbeschale getaucht ist.
>3. Gegenfärbung
- Stellen Sie den Objektträger in eine Färbeschale mit 50 % Hämatoxylin-Färbelösung und lassen Sie ihn 30 s bei Raumtemperatur ruhen. Beachten Sie, dass die Folien violett werden.
- Schieben Sie das Objektträgergestell sofort zurück in eine Färbeschale mit Leitungswasser und waschen Sie die Objektträger 3x–5x, indem Sie das Gestell auf und ab bewegen.
- Wiederholen Sie den Waschschritt mit frischem Leitungswasser, bis die Folien klar sind und die Abschnitte violett bleiben.
- Ersetzen Sie das Leitungswasser in der Färbeschale durch 0,02 % Ammoniakwasser. Bewegen Sie das Gestell 2x bis 3x auf und ab. Beachten Sie, dass der Gewebeschnitt blau werden sollte.
- Ersetzen Sie das Ammoniakwasser durch Leitungswasser. Waschen Sie die Objektträger 3x–5x.
>4. Dehydrierung
- Schieben Sie das Schiebegestell in eine Färbeschale mit 70 % Ethanol im Abzug und lassen Sie es 2 Minuten lang unter gelegentlichem Rühren ruhen.
- Schieben Sie den Schieberost in eine erste Färbeschale mit 100 % Ethanol und lassen Sie ihn unter gelegentlichem Rühren 2 Minuten ruhen.
- Schieben Sie den Objektträger in eine zweite Färbeschale mit 100 % Ethanol und lassen Sie ihn unter gelegentlichem Rühren 2 Minuten ruhen.
- Stellen Sie den Objektträger in eine xylolhaltige Färbeschale und lassen Sie ihn unter gelegentlichem Rühren 5 Minuten ruhen.
>5. Montage von Schienen
- Nehmen Sie die Dias aus dem Schiebegestell und legen Sie sie flach mit den Abschnitten nach oben in den Abzug.
- Montieren Sie jeweils ein Objektträger, indem Sie 1 Tropfen eines Eindeckmediums auf Xylolbasis auf jedes Objektträger geben und vorsichtig ein Deckglas von 24 mm x 50 mm über den Abschnitt legen. Vermeiden Sie es, Luftblasen einzuschließen.
- Trocknen Sie die Objektträger ≥5 Minuten an der Luft.
>6. Auswertung von Stichproben
- Untersuchen Sie die Gewebeschnitte unter einem Standard-Hellfeldmikroskop mit 20- bis 40-facher Vergrößerung.
