Gewinnung von DRG aus der Wirbelsäule der Ratte: Ein Verfahren zur Extraktion des dorsalen Wurzelganglions aus der Wirbelsäule eines Rattenmodells

Zusammenfassung

Quelle: Schmidt, L. B. et al. Das Chick Chorioallantoic Membrane In-vivo-Modell zur Beurteilung der perineuralen Invasion bei Kopf- und Halskrebs. J. Vis. Exp. (2019)

In diesem Video demonstrieren wir die Extraktion von Spinalganglion oder DRG aus einer geernteten Rattenwirbelsäule für nachgelagerte Anwendungen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Ernte und Vorbereitung der DRGs (geschätzte Zeit: 2 h, Tag 8)

HINWEIS: Experimente mit Mäusen und Ratten benötigen eine Genehmigung der IACUC. In einigen Ländern ist auch die Verwendung von Hühnereiern genehmigungspflichtig.

1. Holen Sie sich sechs bis sieben Wochen alte Sprague Dawley-Ratten (~200 g Gewicht), um DRGs zu extrahieren.
   Anmerkung: Eine Ratte sollte ~40 zervikale und thorakale DRGs liefern. Maus-DRG integriert sich auch in das CAM; Die Bedingungen für diese Art müssen jedoch unabhängig voneinander optimiert werden.
2. In einer Laminar-Flow-Kabinett werden DRGs aus zervikalen und thorakalen Regionen gemäß dem an anderer Stelle veröffentlichten Protokoll für die Extraktion von Maus-DRGs entnommen. Befolgen Sie Abbildung 1 zur Orientierung zum Harvesten von DRGs.
   1. Euthanasieren Sie die Ratte durch Herzpunktion nach Verabreichung von Ketamin/Xylazin, das intraperitoneal injiziert wurde. Reinigen Sie die Rattenhaut mit 70% Ethanol und entfernen Sie die Rattenwirbelsäule mit einer Schere. Führen Sie keine Gebärmutterhalsluxation durch, da dies die zervikalen DRGs beschädigen würde.
   2. Trennen Sie den Hals-, Brust- und Lendenwirbelbereich mit derselben Schere und folgen Sie dabei der schematischen anatomischen Darstellung und den groben Bildern in Abbildung 1A-D. Legen Sie die Wirbelsäulenabschnitte in eine 10 cm große Kulturschale mit 1X PBS, um das Gewebe feucht zu halten.
   3. Öffnen Sie mit einer feinen Knochenschere die Wirbelknochen in der dorsalen und ventralen Seite und trennen Sie die Wirbelsäule in zwei seitliche Hälften (Abbildung 1E-F). Legen Sie die Gewebeabschnitte in eine saubere 10 cm lange Schale mit frischem 1X PBS.
   4. Lösen Sie mit einer Pinzette vorsichtig das Rückenmark von den Wirbelknochen, um die DRGs sichtbar zu machen (Abbildung 1G).
   5. Halten Sie eine feine Pinzette unter jede DRG, fassen Sie sie und ziehen Sie sie aus der Knochenhöhle heraus, in der sie steckt. Halten Sie das DRG nicht direkt fest, da dies zu Gewebeschäden führen kann. Schneiden Sie die Axonbündel nicht aus dem DRG ab (Abbildung 1H).
      Anmerkung: Vermeiden Sie die Verwendung von lumbalen DRGs, da diese die Integration in das CAM reduzieren. Für die Position der DRG-Region folgen Sie der schematischen Abbildung und den groben anatomischen Bildern in Abbildung 1A-D.
3. Unmittelbar nach der Entnahme wird jedes DRG in DMEM-Kulturmedium gegeben, das mit 2 % Penicillin/Streptomycin (Pen/Streptomycin) und 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt wird, um eine bakterielle Kontamination der DRGs zu verhindern. Gruppieren Sie alle DRGs in derselben 6-cm-Kulturschale mit 4 ml Kulturmedium.
4. Nach der Ernte aller DRGs werden sie in eine neue Kulturschale mit DMEM-Kulturmedium umgefüllt, das mit 2 % Pen/Strep plus 10 % FBS ergänzt ist und 1,25 μg/ml roten Fluoreszenzfarbstoff enthält. 1 h im Zellkultur-Inkubator inkubieren.

Ergebnisse

Abbildung 1: DRG-Extraktion an Tag 8. A. Schematische Darstellung der anatomischen Lage der Wirbelsäule. B. Diagramm der Konfiguration der Rattenwirbel mit verschiedenen Körperregionen; Grün für den Halswirbel, Dunkelblau für den Brustkorb, Orange für die Lendenwirbel und Hellblau für die Kreuzbeinwirbel. C-D. Ventraler Aspekt der Ratt...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
PBS (1x) pH 7,4	Gibco	# 10010-023	Phosphatgepufferte Kochsalzlösung
Sprague Dawley Ratten (Weibchen)	Laboratorien am Charles River	Stamm-Code: 001	6-7 Wochen alt (190-210 g Gewicht)
Dumont # 5 feine Pinzette	Feinwissenschaftliche Werkzeuge (FST)	# 11254-20	Wird zur Ernte von DRG verwendet
Extra feine Graefe-Pinzette, gebogen	Feinwissenschaftliche Werkzeuge (FST)	# 11151-10	Wird verwendet, um DRG am Tag 8 auf das CAM zu transplantieren und an Tag 17 CAM-Gewebe zu entnehmen
Extra feine Graefe Pinzette, gerade	Feinwissenschaftliche Werkzeuge (FST)	# 11150-10	Wird verwendet, um DRG am Tag 8 auf das CAM zu transplantieren und an Tag 17 CAM-Gewebe zu entnehmen
DMEM (1x)	Gibco	# 11965-092	Dulbeecco's Modifizierter Eagle Medium
CellTracker Roter CMTPX Fluoreszenzfarbstoff	Lebenstechnologien	# Nr. C34552	Rekonstituieren Sie 50 μg in 40 μl DMSO und lagern Sie es bei -20 oC. Verwenden Sie 1 μl Stammlösung/ml Kulturmedium
Stift/Streptokokken	Gibco	# 15140-122	10.000 Einheiten/ml Penicilin, 10.000 μg/ml Streptomycin
HALLO FBS	Gibco	# 10082-147	Hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum
Dmso	Fisher Bioreagenzien	# BP231-100	Dimethylsulfoxid