Chorioallantoische Membran des Kükens oder CAM-Tumormodell: Eine In-Ovo-Methode zur Simulation der perineuralen Invasion von Tumorzellen

Zusammenfassung

Quelle: Schmidt, L. B. et al. Das Chick Chorioallantoic Membrane In-vivo-Modell zur Beurteilung der perineuralen Invasion bei Kopf- und Halskrebs. J. Vis. Exp. (2019)

In diesem Video beschreiben wir die Methode zur Co-Kultur von dorsalen Wurzelganglien und Krebszellen auf der chorioallantoischen Membran oder CAM von Küken, um die perineurale Invasion zu untersuchen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Veredelung DRG auf dem CAM (geschätzte Zeit: 40 min, Tag 8)

1. Bereiten Sie eine 6-cm-Kulturschale mit HBSS-Medium vor, um die DRGs vor der Implantation zu waschen. Bringen Sie die vorbereiteten Eier in den Laminar-Flow-Schrank der Zellkultur. Entfernen Sie die Paraffinmembran vom Ei (Abbildung 1A).
2. Fassen Sie mit einer feinen sterilen Pinzette vorsichtig ein DRG aus dem Inneren des Nährmediums. Tauchen Sie es in das HBSS-Medium, um das überschüssige Medium zu entfernen, das den Fluoreszenzfarbstoff enthält. Halten Sie das DRG sehr vorsichtig; Andernfalls bleibt es an der Pinzette kleben.
3. Platzieren Sie das DRG auf dem CAM und achten Sie darauf, die Membran nicht zu durchstechen (Abbildung 1B-C). Verwenden Sie bei Bedarf eine weitere Pinzette, um die DRG von der Spitze der Pinzette zu lösen, wenn Sie sie auf den CAM legen.
   Anmerkung: Wenn Sie die DRG mit HBSS-Medium nass halten, wird dies auch das Lösen von der Pinzette erleichtert.
4. Decken Sie das Ei mit einem sterilen Klarsichtfolienverband ab. Decken Sie alle Fenster und Einstiche in der Eierschale ab, um eine bakterielle Kontamination zu vermeiden (Abbildung 1D).
5. Nachdem Sie alle Eier mit DRGs veredelt haben, inkubieren Sie die Eier in einem Befeuchtungsbrutator bei 38 °C und 54 % Luftfeuchtigkeit für 2 Tage ohne Rotation.

>2. Transplantation von Tumorzellen auf dem CAM (geschätzte Zeit: 1 h 30 min, Tag 10)

1. 48 Stunden vor der Transplantation der Zellen werden die benötigten Zellen in Kulturplatten plattiert. Berechnen Sie 0,5 bis 1 x 10⁶ Zellen pro Ei für UM-SCC-1-Zellen, um dreidimensionale Tumore in der CAM zu erzeugen. Beachten Sie, dass die Anzahl der Zellen je nach Zelllinie variieren kann.
2. Aspirieren Sie das Medium und fügen Sie DMEM-Kulturmedium hinzu, das mit 1 % Pen/Strep plus 10 % FBS und 2,5 μg/ml grünem Fluoreszenzfarbstoff ergänzt wird. 1 h bei 37 °C im Zellkultur-Inkubator inkubieren. Überprüfen Sie dann die Fluoreszenzintensität am Mikroskop, saugen Sie das Medium an, waschen Sie es einmal mit 1X PBS und fügen Sie 0,25% Trypsin für bis zu 10 Minuten hinzu. Neutralisieren Sie Trypsin mit DMEM-supplementiertem Medium.
3. Bei 250 x g für 4 min zentrifugieren, um ein Zellpellet zu bilden. Aspirieren Sie das DMEM-Medium und resuspendieren Sie es in HBSS, um den überschüssigen Fluoreszenzfarbstoff zu waschen. Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer.
4. Bringen Sie die Eier in den Laminar-Flow-Schrank der Zellkultur. Öffnen Sie mit Schere und Pinzette den transparenten Filmverband, der das Ei bedeckt (Abbildung 1E-F).
5. Die berechnete Anzahl von Zellen wird erneut zentrifugiert, das HBSS-Medium aspiriert und bei einer Endkonzentration von 0,5 bis 1 x 10⁶ Zellen pro 5 μl desselben Mediums resuspendiert (Abbildung 1G). Bereiten Sie die Menge vor, die für die Gesamtzahl der Eizellen benötigt wird (5 μl Zellsuspension pro Ei).
6. Geben Sie 5 μl Zelllösung auf das CAM, etwa 2 mm vom DRG entfernt (Abbildung 1H). Halten Sie gleichmäßige Abstände zwischen dem DRG und den Zellen ein. Achten Sie sehr darauf, die Eizelle nicht zu stören, um die Ausbreitung der Zellen zu minimieren.
   Anmerkung: Um mit der Zellimplantation zu beginnen, wählen Sie Eizellen, auf denen die CAM-Oberfläche visuell trocken ist. Ist die Oberfläche zu nass, können sich Zellen ausbreiten und keine regelmäßigen Tumore bilden.
7. Decken Sie das Ei wie in Schritt 1.4 mit einem neuen Filmverband ab. Pfropfen Sie die Zellen in alle Eizellen. Inkubieren Sie die Eier in einem Befeuchtungsbrutator bei 38 °C und 54 % Luftfeuchtigkeit für 7 Tage, ohne Rotation.

Ergebnisse

Abbildung 1: Transplantation von DRG, Zellen und Ernte von CAM: An Tag 8: A. CAM leicht zu beobachten nach Entfernung der Paraffinwachsmembran. B-C. Mit einer feinen Pinzette wird DRG auf den CAM aufgebracht. D. Das Ei wird mit einer Folie bedeckt und in den Brutkasten gelegt; Pfeile zeigen auf die Öffnungen, die abgedeckt sind.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Brutkasten für Eier	GQF Digitaler Sportler	#1502	Eierbrutkasten mit automatischem Rotator, digitalem Thermostat, Temperatur- und Feuchtigkeitsregelung
Gravierschneider	DREMEL	#108	Wird zum Bohren der Eierschale verwendet
Extra feine Graefe-Pinzette, gebogen	Feinwissenschaftliche Werkzeuge (FST)	#11151-10	Wird verwendet, um DRG an Tag 8 auf das CAM zu transplantieren und an Tag 17 CAMtissue zu entnehmen
Extra feine Graefe Pinzette, gerade	Feinwissenschaftliche Werkzeuge (FST)	#11150-10	Wird verwendet, um DRG an Tag 8 auf das CAM zu transplantieren und an Tag 17 CAM-Gewebe zu entnehmen
Befruchtete Lohmann Weiße Leghorn-Eier			Befruchtete Eizellen an frühen Befruchtungstagen, vorzugsweise am ersten Tag nach der Befruchtung. Die Eier, die in diesem Protokoll verwendet werden, stammen von der Geflügelfarm der Michigan State University.
Filterzange	EMD Millipore	#XX6200006P	Stumpfe Zange zum Entfernen der Eierschale
HBSS (1x)	Gibco	#14025-092	Hank's ausgewogene Salzlösung
Paraffinwachs-Membran	Parafilm Laborfilm	#PM-996	Wird verwendet, um die Eiöffnungen bis zur DRG-Transplantation am 8. Tag vorübergehend abzudecken
PBS (1x) pH 7,4	Gibco	#10010-023	Phosphatgepufferte Kochsalzlösung
Tegaderm Transparenter Filmverband	3M	#9505W	Steril, 6x7 cm zum Abdecken der Eiöffnungen während der Inkubation