Modellierung der intratumoralen Behandlung mit miRNA-Inhibitoren: Eine Methode zur Analyse der Wirkung von miRNA-Inhibitoren auf das Tumorwachstum im Mausmodell

Zusammenfassung

Quelle: Ramirez-Moya, J. et al. In-vivo-Hemmung von microRNA zur Verringerung des Tumorwachstums bei Mäusen. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video zeigt die in vivo Verabreichung von miRNA-Inhibitoren als Therapeutika gegen Tumorwachstum in orthotopen Mausmodellen. Die intratumorale Verabreichung von synthetischen miRNA-Inhibitoren oder AntagomiRs ermöglicht es ihnen, endogene miRNAs zu binden und zu hemmen, wodurch eine mRNA-Hochregulierung und eine Unterdrückung des Tumorwachstums bewirkt wird.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Flankeninokulation von Zellen und intratumorale AntagomiR-Behandlung

1. Vorbereitung der Zellen
   1. Entwicklung einer humanen Cal62-Schilddrüsenkrebszelllinie (KRASG12R- und p53A161D-Mutationen) zur Überexpression eines transgenen Konstrukts, das konstitutiv GFP und Luciferase exprimiert (CMV-Firefly, Luc-IRES-eGFP). Selektion der transgenen Zellen durch Antibiotikaresistenz oder durch Sortierung der GFP-positiven Zellen mittels Durchflusszytometrie.
   2. Züchten Sie die Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), das mit Penicillin, Streptomycin und 10 % fötalem Rinderserum (FBS) bei 37 °C und 5 % CO₂ ergänzt wird.
   3. 1 x 10⁶ Zellen in 50 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei 4 °C suspendieren.
2. Zellinokulation in die Flanken von Mäusen
   1. Mischen Sie die Zellen mit der gleichen Menge Basalmembranmatrix. Fügen Sie z. B. 1 x 10⁶ Zellen in 50 μl PBS zu 50 μl Basalmembranmatrix hinzu (siehe Materialtabelle) und mischen Sie vorsichtig.
   2. Injizieren Sie 100 μl der Probe (Zellen in PBS + Basalmembranmatrix) subkutan in die linke Flanke von 6 Wochen alten immundefizienten BALB/c nu/nu-Mäusen mit einer 1-ml-Insulinspritze und einer 27G 1/2'' (0,4x13 mm) Nadel.
3. Intratumorale AntagomiR-Behandlung
   1. Die AntagomiR (siehe Materialtabelle) oder die Negativkontrolle in 500 μl RNase-freiem destilliertem Wasser suspendieren.
   2. Vor der Injektion sind 2 nmol des AntagomiR oder der Kontrolle zusammen mit einem In-vivo-Verabreichungsreagenz (siehe Materialtabelle) für jede Injektion vorzubereiten.
      1. Mischen Sie zunächst die AntagomiR-Lösung (siehe Materialtabelle) und den Komplexierungspuffer (siehe Materialtabelle) im Verhältnis 1:1. Fügen Sie beispielsweise 80 μl miRNA-Inhibitorlösung (16 nmol) zu 80 μl Komplexierungspuffer hinzu (im In-vivo-Verabreichungsreagenzien-Kit enthalten, siehe Materialtabelle).
      2. Bringen Sie das In-vivo-Verabreichungsreagenz auf Raumtemperatur. Geben Sie 160 μl in ein 1,5-ml-Röhrchen und fügen Sie sofort 160 μl verdünnte AntagomiR-Lösung hinzu. Das restliche Reagenz wieder auf -20 °C einstellen. Lagern Sie das Reagenz bei Bedarf bis zu einer Woche nach dem Auftauen bei 4 °C.
      3. Sofort (10 s) vortexen, um die Komplexierung des in vivo Verabreichungsreagenz-AntagomiR sicherzustellen.
      4. Das Inkubationsreagenz-AntagomiR-Gemisch in vivo wird 30 Minuten lang bei 50 °C inkubiert. Das Röhrchen wird kurz zentrifugiert, um die Probe zu gewinnen.
      5. Verdünnen Sie den Komplex 6-fach durch Zugabe von 1360 μL PBS pH 7,4 und mischen Sie ihn gut.
      6. Fahren Sie mit der In-vivo-Verabreichung des Reagenz-AntagomiR-Komplexes fort (8 Mäuse/Zustand) oder lagern Sie den Komplex bis zu einer Woche vor der Injektion bei 4 °C. Injizieren Sie 200 μl intratumoral in jeden Tumor (2 nmol AntagomiR).
         HINWEIS: Das Volumen und die Menge des AntagomiR ist unabhängig vom Tumorvolumen.
   3. Führen Sie die Behandlung 2 Wochen lang 3 Mal pro Woche (Montag, Mittwoch und Freitag) durch.
4. Analyse des Tumorwachstums
   1. Injizieren Sie zu jedem Zeitpunkt 50 μl einer 40 mg/ml-Lösung von D-Luciferin-Substrat (siehe Materialtabelle) subkutan mit einer 1-ml-Spritze mit einer 27G 1/2'' (0,4 mm x 13 mm) Nadel.
      1. 8 Minuten nach der Injektion betäuben Sie die Mäuse mit 3% Isofluran, gemischt mit Sauerstoff. Beurteilen Sie den Grad der Anästhesie durch den Pedalreflex (festes Einklemmen der Zehen) und passen Sie die Anästhesieabgabe entsprechend an, um die chirurgische Ebene aufrechtzuerhalten.
      2. Tragen Sie eine Augensalbe auf beide Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern.
5. Bilde das Biolumineszenzsignal mit einer In-vivo-Bildgebungssoftware ab (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Messschieber können auch verwendet werden, um das Tumorvolumen und das Tumorwachstum zu messen.
6. Sobald die Biolumineszenzsignale erhalten sind, analysieren Sie das Tumorwachstum, vergleichen Sie beide Behandlungen und bestimmen Sie die Signifikanz mit einem t-Test. Um die Varianz innerhalb der Gruppe zu analysieren, verwenden Sie das SEM.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Basalmembranmatrix: Matrigel Basalmembranmatrix mit hoher Konzentration	Corning	#354248
AntagomiR: mirVana miRNA-Inhibitor	Thermo Fischer	4464088	In vivo bereit
In-vivo-Verabreichungsreagenz: Invivofectamine 3.0 Reagenz	Thermo Fischer	IVF 3005
Negative Kontrolle: mirVana miRNA Inhibitor, Negative Kontrolle #1	Thermo Fischer	4464077	In vivo bereit
XenoLight D-Luciferin - K+ Salz Biolumineszierendes Substrat	PerkinElmer	122799	Verdünnt in PBS
In-vivo-Bildgebungssoftware: IVISLumina II Bildgebungssystem	Caliper Biowissenschaften