Einbettung von 3D-Sphäroiden in Agarose-Geltropfen: Eine Technik zur Konservierung von Sphäroiden für die nachgelagerte Analyse

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Rolver, M. G. et al. Bewertung der Lebensfähigkeit und des Zelltods in 3D-Sphäroidkulturen von Krebszellen. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video beschreibt die Technik zum Einbetten von 3D-Sphäroiden in Agarose-Geltropfen zur Konservierung. Die eingebetteten 3D-Sphäroide können für die nachgelagerte Analyse weiter verwendet werden.

Protokoll

>1. Einbetten von 3D-Sphäroiden

Bereiten Sie das Agarose-Gel vor, in das die Sphäroide eingebettet sind (nur bei der ersten Durchführung des Protokolls erforderlich)
1. Mischen Sie 1 g Bacto-Agar in 50 mL ddH₂O.
2. In der Mikrowelle langsam erhitzen, bis sich der Bacto-Agar aufgelöst hat und sich ein homogenes Gel gebildet hat. Lassen Sie das Gel nicht kochen.
3. Halten Sie das Bacto-Agar in einem Wasserbad bei 60 °C warm.
4. Zwischen den Versuchen bei 4 °C halten.
Einbettung von Sphäroiden
1. An Tag 1 wird für jede Bedingung mindestens 12 Sphäroide in einem 1,5-ml-Röhrchen gepoolt.
2. Einmal mit 1 mL eiskaltem 1X PBS waschen.
3. Um die Sphäroide zu fixieren, fügen Sie 1 ml 4% Paraformaldehyd hinzu.
  Anmerkung: Der Umgang mit Paraformaldehyd sollte in einem Abzug erfolgen.
4. Lassen Sie sie 24 Stunden bei RT inkubieren.
5. Erhitzen Sie das Agarose-Gel an Tag 2 vorsichtig, indem Sie es in ein mit Wasser gefülltes Becherglas in der Mikrowelle geben. Achten Sie darauf, dass das Gel nicht kocht. Bis zur Verwendung auf einer Tischheizplatte bei 60 °C warm halten.
6. Waschen Sie die Sphäroide zweimal mit 1 mL eiskaltem 1X PBS.
7. Aspirieren Sie den größten Teil des 1X PBS (es ist praktisch, an dieser Stelle etwa 100 μl zu verbleiben, was für die Handhabung der Sphäroide praktisch ist).
8. Bereiten Sie eine 20-μl-Pipette vor, indem Sie die Pipettenspitze schräg abschneiden, um eine spitzere Spitze mit einem größeren Loch zu erhalten (Abbildung 1).
  HINWEIS: Der nächste Teil muss schnell durchgeführt werden, um einen optimalen Sphäroidtransfer zu gewährleisten und eine Verfestigung des Geltropfens zu vermeiden. Wenn kein Heizblock verfügbar ist, wird empfohlen, zuerst die Sphäroide aufzufangen und dann die Agarose fallen zu lassen (d. h. die Reihenfolge der Punkte 1.2.9 und 1.2.10 zu ändern).
9. Machen Sie einen Agarose-Gel-Tropfen auf einen Objektträger. Legen Sie den Objektträger auf einen warmen Heizblock, um zu verhindern, dass sich die Agarose verfestigt.
10. Mit der modifizierten Pipettenspitze (Schritt 1.2.8) werden so viele Sphäroide wie möglich in einem Volumen von 15–20 μl aufgefangen.
11. Injizieren Sie das 15–20 μl sphäroidhaltige 1X PBS vorsichtig in die Mitte des Agarose-Geltropfens, ohne den Objektträger zu berühren.
  Anmerkung: Das ist ein etwas schwieriger Punkt. Die Sphäroide gehen verloren, wenn die Pipettenspitze beim Injizieren der Sphäroide in den Geltropfen den Objektträger berührt. Es ist ratsam, den gesamten Prozess der Herstellung des Agarosetropfens und der Injektion der Sphäroide zu üben, indem eine farbige Flüssigkeit in den Tropfen injiziert wird. Dies ermöglicht die Visualisierung eines möglichen Eindringens durch den Tropfen, da die farbige Flüssigkeit auf den Objektträger austritt.
12. Lassen Sie den Agarose-Gel-Tropfen aushärten, indem Sie ihn 5–10 Minuten bei RT oder 4 °C inkubieren. Wenn sich der Geltropfen etwas verfestigt hat (aber immer noch ziemlich weich ist), schieben Sie den Geltropfen vorsichtig mit einem Skalpell vom Objektträger in eine Plastikgewebekassette.
13. Decken Sie die Plastik-Tissue-Kassetten mit 70% Ethanol ab.
  Anmerkung: Zu diesem Zeitpunkt können die Sphäroide direkt verwendet oder monatelang gelagert werden.
14. Betten Sie das in Agarose eingebettete Sphäroid in Paraffin ein, schneiden Sie es in 2–3 μm dicke Objektträger und färben Sie es mit Hämatoxylin und Eosin oder unterziehen Sie es einer immunhistologischen Färbung.

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Ergebnisse

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Abbildung 1: Fixierung, Einbettung und immunhistochemische Analyse von Sphäroiden. (A) Schematische Darstellung des Protokolls zur Einbettung von Sphäroiden. Einzelne Schritte sind mit (i-vii) gekennzeichnet. (B) Bild des eingebetteten Sphäroids MDA-MB-231. Maßstabsbalken: 50 μm. (C) Repräsentatives Bild eines mit Chem...