$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Alle Verfahren, die Tiere betreffen, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereitung der extrazellulären Matrix (TEM) der Zunge
- Exekutieren Sie Mäuse durch Gebärmutterhalsluxation und entfernen Sie die Zungen mit einer sterilen chirurgischen Schere und Pinzette.
- Tauchen Sie die Zungen 3 Minuten lang in 75%iges Ethanol und legen Sie dann jede Zunge in ein 1,5 mL Eppendorf (EP) Röhrchen mit 1 mL steriler phosphatgepufferter 10 mM Lösung.
Anmerkung: Die Konzentration von PBS in allen folgenden Schritten ist die gleiche wie die Konzentration in diesem Schritt.
- Zelllyse durch Einfrieren-Auftauen: Frieren Sie die Zungen in EP-Röhrchen bei -80 °C für 1 h ein und tauen Sie die Zungen dann bei Raumtemperatur für 45 min für 3 Zyklen auf.
- Legen Sie jede Zunge mit einer chirurgischen Nadel auf ein Stück chirurgisches Nahtmaterial und umwickeln Sie das Ende der Naht mit einem kleinen Stück steriler Alufolie. Der Vorgang wird in einer 3,5 cm oder 6 cm großen Kulturschale mit 75 % Ethanol unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
Anmerkung: Die geeignete Länge jedes Stücks chirurgischer Naht beträgt etwa 20 cm, und die geeignete Größe jedes Stücks Alufolie beträgt etwa 0,3 cm2 (1 cm x 0,3 cm). Die Zunge sollte in der Nähe der Alufolie eingelegt werden.
- Spülen Sie jede Zunge 30 s lang mit 3 ml sterilem PBS in einer 3,5 cm oder 6 cm großen Kulturschale. Führen Sie diesen Vorgang unter sterilen Bedingungen durch.
- Waschen Sie die Zunge mit Reinstwasser: Geben Sie Ampicillin in eine Weithalsflasche mit 250 mL sterilem Reinstwasser bis zu einer Endkonzentration von 90 μg/mL. Stecken Sie die Zungen in die Flasche mit einem Rührstab. Ziehen Sie den Flaschenverschluss fest, wobei ein Teil der Naht außerhalb der Flasche verbleibt. Führen Sie diesen Vorgang unter sterilen Bedingungen durch.
Anmerkung: Es können bis zu 5 Zungen in die gleiche Flasche gesteckt werden, unter Berücksichtigung der Verflechtung der Naht. Die Alufolie befindet sich am Ende der Naht in der Flasche, um ein Abrutschen der Zunge zu verhindern. Die Zungen sollten 2 cm hoch vom Boden der Flasche entfernt platziert werden, indem die Länge der in der Flasche verbleibenden Naht angepasst wird. Dieser Hinweis gilt auch für die Schritte 1.8, 1.10, 1.12 und 1.16.
- Stellen Sie die Flasche für 12 h auf einen Magnetrührer.
- Waschen Sie die Zunge mit NaCl: Geben Sie Ampicillin in eine Weithalsflasche mit 250 mL sterilem 1 M NaCl bis zu einer Endkonzentration von 90 μg/mL. Bewegen Sie die Zungen und den Rührstab in die Flasche. Ziehen Sie den Flaschenverschluss fest, wobei ein Teil der Naht außerhalb der Flasche verbleibt. Führen Sie diesen Vorgang unter sterilen Bedingungen durch.
- Stellen Sie die Flasche für 24 h auf einen Magnetrührer.
- Zelllyse mit Triton X-100: Geben Sie Ampicillin bis zu einer Endkonzentration von 90 μg/ml in eine Weithalsflasche mit 250 ml sterilem 2% Triton X-100 in PBS. Bewegen Sie die Zungen und den Rührstab in die Flasche. Ziehen Sie den Flaschenverschluss fest, wobei ein Teil der Naht außerhalb der Flasche verbleibt. Führen Sie diesen Vorgang unter sterilen Bedingungen durch.
- Stellen Sie die Flasche für 48 h auf einen Magnetrührer.
- Waschen Sie die Zunge mit CaCl2/MgCl2: Geben Sie Ampicillin in eine Weithalsflasche mit 250 ml sterilem 5 mM CaCl2/MgCl2 bis zu einer Endkonzentration von 90 μg/ml. Bewegen Sie die Zungen und den Rührstab in die Flasche. Ziehen Sie den Flaschenverschluss fest, wobei ein Teil der Naht außerhalb der Flasche verbleibt. Führen Sie diesen Vorgang unter sterilen Bedingungen durch.
- Stellen Sie die Flasche für 24 h auf einen Magnetrührer.
- Aufschluss durch DNase: Geben Sie 1 ml Hank's balanced salt solution (HBSS) in jedes EP-Röhrchen. Geben Sie DNase in HBSS bzw. bis zu einer Endkonzentration von 300 μM. Bewegen Sie jede Zunge in jedes EP-Röhrchen, wobei ein Teil der Naht außerhalb des Röhrchens liegt. Führen Sie diesen Vorgang unter sterilen Bedingungen durch.
Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass der Teil des Nahtmaterials, der in den vorherigen Schritten in den Flaschen verbleibt, auch in diesem Schritt im EP-Röhrchen verbleibt, und stellen Sie sicher, dass der Teil des Nahtmaterials, der in den vorherigen Schritten außerhalb der Flaschen verbleibt, auch in diesem Schritt außerhalb des EP-Röhrchens verbleibt.
- Die Zungen in EP-Röhrchen bei 37 °C für 24 h inkubieren.
- Waschen Sie die Zunge mit PBS: Geben Sie Ampicillin in eine Weithalsflasche mit 250 ml sterilem PBS bis zu einer Endkonzentration von 90 μg/ml. Bewegen Sie die Zungen und den Rührstab in die Flasche. Ziehen Sie den Flaschenverschluss fest, wobei ein Teil der Naht außerhalb der Flasche verbleibt. Führen Sie diesen Vorgang unter sterilen Bedingungen durch.
- Stellen Sie die Flasche für 24 h auf einen Magnetrührer.
- Lagern Sie das vorbereitete TEM bis zur Verwendung in sterilem PBS bei 4 °C.