Methodenartikel

Kryomahlen von dezellularisiertem Gewebe: eine Technik zur Gewinnung von feinem extrazellulärem Matrixpulver

30. April 2023

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Quelle: Kornmüller, A. et al. Herstellung von extrazellulären Matrix-abgeleiteten Schäumen und Microcarriern als gewebespezifische Zellkultur- und Verabreichungsplattformen. J. Vis. Exp. (2017)

In diesem Video stellen wir das Protokoll zur Gewinnung von fein gemahlenem extrazellulärem Matrixpulver aus lyophilisiertem dezellularisiertem Gewebe durch Kryomahlen vor. Das pulverförmige ECM behält seine biochemische Zusammensetzung und kann für die Microcarrier-Synthese verwendet werden.

Protokoll

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>1. Dezellularisierte Gewebeverarbeitung

  1. Dezellularisierung und Lyophilisierung
    1. Dezellularisieren Sie Gewebe von Interesse nach einem festgelegten Protokoll.
      Anmerkung: Die Gerüste in der aktuellen Studie wurden nach veröffentlichten Dezellularisierungsprotokollen für humanes DAT, Schweine-DDT und Schweine-DLV erstellt. Im Handel erhältliches, unlösliches Kollagen kann auch zur Herstellung von Schäumen und Microcarriern verwendet werden, wie z. B. Kollagen aus Rindersehnen, das erfolgreich über einen Konzentrationsbereich von 10 bis 50 mg/ml verwendet wurde. Andere unlösliche Kollagenquellen können verwendet werden, erfordern jedoch möglicherweise eine Optimierung, um den Konzentrationsbereich zu identifizieren, der stabile Gerüste ergibt.
    2. Übertragen Sie das hydratisierte dezellularisierte Gewebe oder das gereinigte Kollagen mit einer Pinzette in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie ausreichend doppelt destilliertes Wasser (ddH₂O) hinzu, um das Gewebe auf ein maximales Gesamtvolumen von 35 ml einzutauchen.
    3. Frieren Sie die Probe über Nacht bei -80 °C ein, wobei das Zentrifugenröhrchen während des Einfrierens horizontal positioniert wird, um die Oberfläche für die Sublimation während der anschließenden Gefriertrocknung zu maximieren.
    4. Entfernen Sie die Kappe vom Zentrifugenröhrchen und geben Sie die gefrorene Probe in ein Gefriertrocknungsglas.
    5. Lyophilisieren Sie die Probe mit einem Labor-Gefriertrockner für 48–72 h oder bis sie vollständig getrocknet ist.
      Anmerkung: Die Trocknungszeit kann bei verschiedenen Lyophilisatoren und dezellularisierten Geweben variieren.
    6. Die lyophilisierte EZM mit einer scharfen chirurgischen Schere fein in kleine Stücke (~ 1–2 mm3) zerkleinern.
    7. Lagern Sie das zerkleinerte ECM in einem Exsikkator, bis es für die weitere Verarbeitung bereit ist.
      Anmerkung: Es wird empfohlen, das zerkleinerte ECM sofort zu verwenden, um eine Feuchtigkeitsaufnahme aus der Umgebung zu verhindern.
  2. Kryofräsen (optional für die Schaumherstellung)
    1. Füllen Sie eine 25 mL Edelstahl-Mahlkammer für ein Labor-Kugelmühlensystem mit zerkleinerter lyophilisierter ECM und fügen Sie zwei 10 mm Edelstahl-Mahlkugeln hinzu.
    2. Schließen Sie die beladene Mahlkammer und tauchen Sie sie für 3 min vollständig in flüssigen Stickstoff.
    3. Mahlen Sie die gefrorene Probe 3 Minuten lang bei 30 Hz (1.800 U/min).
    4. Die Schritte 1.2.2 und 1.2.3 werden wiederholt, bis das ECM zu einem feinen Pulver gemahlen ist.
      Anmerkung: Die Häufigkeit, mit der diese Schritte wiederholt werden sollten, kann je nach ECM-Quelle variieren. Zum Beispiel erfordert DAT typischerweise 3 Mahlzyklen, um ein feines Pulver zu erzeugen.
    5. Das Pulver mit einer Schöpfel in ein Glasfläschchen geben, fest verschließen und in einem Exsikkator aufbewahren.

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Offenlegungen

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Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Leinen aus KrokodilklemmeVWRArtikel-Nr.: 470149-728
AlufolieFisher ScientificTel.: 01-213-101
Analytische WaageSchneidermuskelCPA225D
Kryo-FräsanlageRetschArtikel-Nr.: 20.745.0001MM 400
ExsikkatorFisher Scientific8624426Für die Lagerung von lyophilisierter EZM und Biogerüsten
DewargefäßFisher ScientificArtikel-Nr.: 10-196-6Niedrige Form; Volumenbereich von 250 - 500 mL
Doppelt destilliertes Wasser (ddH2O)Vom Barnstead GenPure xCAD Wasseraufbereitungssystem
ECM (Extrazelluläre Matrix)Isoliert aus menschlichem Fettgewebe, Schweinedermis oder Schweinemyokard, wie in Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010 und Wainwright et al. 2010 beschrieben
ZangeVWRTel.: 37-501-32Zum Übertragen der Schäume
Gefrierschrank (-20 °C)VWRTel.: 97043-346
Gefrierschrank ( -80 °C)Thermo ScientificEXF40086A
Fläschchen aus GlasFisher Scientific03-339-26DZur Lagerung von lyophilisiertem, kryogemahlenem ECM
FlüssigstickstoffZum Elektrospritzen
LyophilisiererLabconco7750021FreeZone4.5
MahlkammerRetschTel.: 02.462.021325 mL Volumen empfohlen
Kugeln fräsenVWRNr. 16003-60610 mm Durchmesser, Edelstahl empfohlen
Penicillin-StreptomycinLebenstechnologienNr. 15140-122Wird für Proliferationsmedien verwendet
Pipet-Aid-EPMandel ScientificDRU-4-000-101
ScoopulaVWRTel.: 89259-968Zum Sammeln von Microcarriern
Chirurgische SchereVWRTel.: 82027-590

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Schlagwörter

lyophilisierte ECMMahlbecherfl ssiger StickstoffEdelstahlkugelnPartikelgr enverteilungbiochemische ZusammensetzungMicrocarrier Synthese

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