Herstellung der EZM-Suspension: Eine Technik zur Gewinnung einer homogenen Suspension aus einer aus dem Gewebe stammenden extrazellulären Matrix

Zusammenfassung

Quelle: Kornmüller, A. et al. Herstellung von extrazellulären Matrix-abgeleiteten Schäumen und Microcarriern als gewebespezifische Zellkultur- und Verabreichungsplattformen. J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video beschreibt die Herstellung einer homogenisierten und verdauten extrazellulären Matrixsuspension aus dezellularisiertem und lyophilisiertem Gewebe. Diese Technik hilft bei der Herstellung von EZM-abgeleiteten porösen Schäumen und Mikrocarriern für die Verwendung als Substrate in fortschrittlichen 3D-Zellkulturmodellen.

Protokoll

>1. Dezellularisierte Gewebeverarbeitung

1. Dezellularisierung und Lyophilisierung
   1. Dezellularisieren Sie Gewebe von Interesse nach einem festgelegten Protokoll.
      Anmerkung: Die Gerüste in der aktuellen Studie wurden nach veröffentlichten Dezellularisierungsprotokollen für humanes dezellularisiertes Fettgewebe (DAT), dezellularisiertes Hautgewebe (DDT) und dezellularisiertes linkes Ventrikel (DLV) von Schweinen erstellt. Im Handel erhältliches, unlösliches Kollagen kann auch zur Herstellung von Schäumen und Microcarriern verwendet werden, wie z. B. Kollagen aus Rindersehnen, das erfolgreich über einen Konzentrationsbereich von 10 bis 50 mg/ml verwendet wurde. Andere unlösliche Kollagenquellen können verwendet werden, erfordern jedoch möglicherweise eine Optimierung, um den Konzentrationsbereich zu identifizieren, der stabile Gerüste ergibt.
   2. Übertragen Sie das hydratisierte dezellularisierte Gewebe oder gereinigtes Kollagen mit einer Pinzette in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie ausreichend doppelt destilliertes Wasser (ddH₂O) hinzu, um das Gewebe auf ein maximales Gesamtvolumen von 35 ml einzutauchen.
   3. Frieren Sie die Probe über Nacht bei -80 °C ein, wobei das Zentrifugenröhrchen während des Einfrierens horizontal positioniert wird, um die Oberfläche für die Sublimation während der anschließenden Gefriertrocknung zu maximieren.
   4. Entfernen Sie die Kappe vom Zentrifugenröhrchen und geben Sie die gefrorene Probe in ein Gefriertrocknungsglas.
   5. Lyophilisieren Sie die Probe mit einem Labor-Gefriertrockner für 48–72 h oder bis sie vollständig getrocknet ist.
      Anmerkung: Die Trocknungszeit kann bei verschiedenen Lyophilisatoren und dezellularisierten Geweben variieren.
   6. Die lyophilisierte EZM mit einer scharfen chirurgischen Schere fein in kleine Stücke (~1–2 mm³) zerkleinern.
   7. Lagern Sie das zerkleinerte ECM in einem Exsikkator, bis es für die weitere Verarbeitung bereit ist.
      Anmerkung: Es wird empfohlen, das zerkleinerte ECM sofort zu verwenden, um eine Feuchtigkeitsaufnahme aus der Umgebung zu verhindern.
2. Kryofräsen
   1. Füllen Sie eine 25 mL Edelstahl-Mahlkammer für ein Labor-Kugelmühlensystem mit zerkleinerter lyophilisierter ECM und fügen Sie zwei 10 mm Edelstahl-Mahlkugeln hinzu.
   2. Schließen Sie die beladene Mahlkammer und tauchen Sie sie für 3 min vollständig in flüssigen Stickstoff.
   3. Mahlen Sie die gefrorene Probe 3 Minuten lang bei 30 Hz (1.800 U/min) zu einem feinen Pulver.
      Anmerkung: Die Häufigkeit, mit der diese Schritte wiederholt werden sollten, kann je nach ECM-Quelle variieren. Zum Beispiel erfordert DAT typischerweise 3 Mahlzyklen, um ein feines Pulver zu erzeugen.
3. Vorbereitung der ECM-Suspension
   1. Wiegen Sie 250 mg zerkleinertes (für Schäume) oder kryogemahlenes (für Schäume oder Microcarrier) ECM ab und geben Sie es in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Siehe Schritt 1.1.6 und Abschnitt 1.2 zur Herstellung von zerkleinerter ECM bzw. kryogemahlener ECM.
      Anmerkung: Dieses Protokoll wurde entwickelt, um eine 50 mg/ml-ECM-Suspension herzustellen, die für humane DAT, Schweine-DDT und Schweine-DLV empfohlen wird. Abhängig von der spezifischen ECM-Quelle können gleichmäßige Suspensionen bei höheren oder niedrigeren Ausgangskonzentrationen erzeugt werden.
   2. Geben Sie 5 ml 0,22 M NaH₂PO₄ (pH 5,4) Puffer in das Zentrifugenröhrchen und markieren Sie den Flüssigkeitsstand auf dem Röhrchen.
   3. Bereiten Sie eine α-Amylase-Stammlösung vor, indem Sie 7,5 mg α-Amylase zu 1 ml 0,22 M NaH₂PO₄ (pH 5,4) Puffer hinzufügen. Geben Sie 100 μl der α-Amylase-Stammlösung (0,75 mg α-Amylase: 0,3 Gew.-% Trockengewebe) in die Probe. Fügen Sie 0,22 M NaH₂PO₄ hinzu, um ein Endvolumen von 10 mL zu erhalten.
   4. Die Federung wird 72 Stunden lang bei Raumtemperatur kontinuierlich bei 300 U/min gerührt.
   5. Die Suspension wird bei 1.500 x g für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wird vorsichtig aufgefangen und entsorgt, ohne das aufgeschlossene ECM-Pellet zu stören. Das pelletierte Material wird in 10 mL 5 % NaCl, verdünnt in ddH₂O, resuspendiert.
   6. Schritt 1.3.5 für insgesamt zwei Spülgänge mit 5 % NaCl in ddH₂O wiederholen.
   7. Der Überstand wird verworfen und das pelletierte Material in 10 mL ddH₂O resuspendiert.
   8. Bewegen Sie die Federung kontinuierlich bei 300 U/min für 10 min bei RT.
   9. Die Suspension wird bei 1.500 x g für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wird vorsichtig aufgefangen und entsorgt, ohne das aufgeschlossene ECM-Pellet zu stören.
   10. 0,2 M Essigsäure zu der in Schritt 1.3.2 vorgenommenen 5-ml-Markierung hinzufügen.
   11. Die Federung kontinuierlich bei 120 U/min O/N bei 37 °C bewegen.
   12. Homogenisieren Sie die ECM-Suspension bei Raumtemperatur in 10-Sekunden-Intervallen mit einem Handhomogenisator, der mit einer 10 mm breiten Sägezahnsonde ausgestattet ist, bis keine sichtbaren Fragmente mehr übrig sind. Die Suspension wird zwischen den Homogenisierungsintervallen in ein Becherglas mit kaltem Wasser gegeben, um eine Überhitzung zu vermeiden.
       Anmerkung: Abhängig von der EZM-Quelle kann eine weitere Verdünnung in 0,2 M Essigsäure erforderlich sein, um eine homogene Suspension zu erhalten. Eine übermäßige Abkühlung der ECM-Suspension kann zu einer Erhöhung der Viskosität führen, die eine effiziente Homogenisierung beeinträchtigen kann. Wird ein Anstieg der Viskosität festgestellt, kann die Probe wieder auf 37 °C erwärmt und einer weiteren Verarbeitung unterzogen werden.
   13. Bis zu einem Monat vor der Herstellung von Schaumstoff oder Microcarriern bei 4 °C lagern.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Essigsäure, eiskalt	BioShop	ACE222.5
α-Amylase	Sigma	101074694	von Aspergillus aryzae
Zentrifuge 75004251	Thermo Scientific		Mit schwingendem Schaufelrotor für 15 & 50 mL Zentrifugenröhrchen
Zentrifugenröhrchen (15 mL)	Sarstedt	Artikel-Nr.: 62.554.205
Exsikkator	Fisher Scientific	8624426	Für die Lagerung von lyophilisierter EZM und Biogerüsten
Doppelt destilliertes Wasser (ddH2O)			Vom Barnstead GenPure xCAD Wasseraufbereitungssystem
ECM (Extrazelluläre Matrix)			Isoliert aus menschlichem Fettgewebe, Schweinedermis oder Schweinemyokard, wie in Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010 und Wainwright et al. 2010 beschrieben (Ref # 28, 8, 32)
Tragbarer Homogenisator	Fisher Scientific	Tel.: 14-359-251	Drehzahl: 8.000 - 30.000 U/min
Zubehör für Homogenisatoren: Sonden für Sägezahn-Bodengeneratoren	Fisher Scientific	Tel.: 14-261-17	ca. 10 x 95 mm
Flüssigstickstoff
Natriumchlorid	BioShop	Artikel-Nr.: 7647-14-5
Natriumphosphat einbasisch	BioShop	Artikel-Nr.: 10049-21-5
Chirurgische Schere	VWR	Tel.: 82027-590