Herstellung von Schaum aus extrazellulärer Matrix durch Lyophilisierung: Ein Verfahren zur Erzeugung biologischer Gerüste aus EZM von dezellularisiertem Gewebe

Zusammenfassung

Quelle: Kornmüller, A. et al. Herstellung von extrazellulären Matrix-abgeleiteten Schäumen und Microcarriern als gewebespezifische Zellkultur- und Verabreichungsplattformen. J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video beschreibt das Verfahren zur Synthese von reinen ECM-abgeleiteten Schäumen, ohne dass eine chemische Vernetzung erforderlich ist. Diese aus der EZM gewonnenen Schaumstoffe finden Anwendung als fortschrittliche 3D-In-vitro-Zellkulturmodelle oder als pro-regenerative Biogerüste.

Protokoll

>1. ECM-abgeleitete Schaumherstellung

1. Die homogene ECM-Suspension wird durch Dispergieren des feinen ECM-Pulvers in einer Pufferlösung hergestellt und bei 37 °C unter ständigem Rühren bei 120 U/min inkubiert, bis die Suspension warm ist.
2. Die ECM-Suspension wird in 0,2 M Essigsäure auf die gewünschte Konzentration verdünnt.
   Anmerkung: Abhängig von der ECM-Quelle können stabile Schäume im Bereich von 10–100 mg/ml hergestellt werden, wobei 15–50 mg/ml der empfohlene Bereich für DAT, DDT und DLV ist. In der Regel sind Schaumstoffe, die in höheren Konzentrationen hergestellt werden, etwas weniger porös, aber in Kultur stabiler und einfacher zu handhaben.
3. Füllen Sie die gewünschte Form mit einer 3-ml-Spritze und einer 18G-Nadel, um die Blasenbildung in der ECM-Suspension zu verhindern, und füllen Sie die gewünschte Form mit der ECM-Suspension. Zur Herstellung der DAT-, DDT- und DLV-Schäume dosieren Sie 400 μl 35 mg/ml ECM-Suspension in eine mit Zellkulturen behandelte 48-Well-Platte.
   Anmerkung: Die Form der ausgewählten Form und das Volumen der ECM-Suspension bestimmen die Geometrie des resultierenden Schaums.
4. Decken Sie die Formen ab und frieren Sie sie über Nacht ein, indem Sie sie in einen -20 °C oder -80 °C Gefrierschrank stellen.
   Anmerkung: Die Gefriertemperatur kann die Porosität der Schäume beeinflussen. Beim Einfrieren der Proben bei -20 °C im Vergleich zu -80 °C sind größere Poren zu erwarten, da sich größere Eiskristalle bilden. Um Schaumstoffe mit einer gleichmäßigen porösen Struktur herzustellen, stellen Sie sicher, dass die Form nicht mit einer leitfähigen Oberfläche in Berührung kommt, um eine gerichtete Abkühlung zu verhindern.
5. Die Formen mit den gefrorenen Proben werden in einen Gefrierkolben gegeben. Schließen Sie den Gefrierkolben an das Labor-Gefriertrocknersystem an und trocknen Sie ihn 24 h.
   HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Probe vor der Gefriertrocknung eingefroren bleibt.
6. Lagern Sie die lyophilisierten Schäume bis zur Verwendung in einem Exsikkator.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Analytische Waage	Schneidermuskel	CPA225D
Zentrifugenröhrchen (15 mL)	Sarstedt	Artikel-Nr.: 62.554.205
Zentrifugenröhrchen (50 mL)	Sarstedt	Artikel-Nr.: 62.547.205
Kollagen aus der Rinderachilless Sehne (unlöslich)	Sigma	Nr. C9879	Oder ähnliches unlösliches Kollagen Quelle; Kann als verwendet werden Alternative zu dezellularisiert Gewebe zur Herstellung der Schäume und Mikrocarrier
Exsikkator	Fisher Scientific	8624426	Für lyophilisierte ECM und Lagerung von Biogerüsten
Dewargefäß	Fisher Scientific	Artikel-Nr.: 10-196-6	Niedrige Form; Volumenbereich von 250 -500 mL
Doppelt destilliertes Wasser (ddH_{2} O)			Von Barnstead GenPure xCAD Wasseraufbereitungssystem
D-PBS (phosphatgepuffert Kochsalzlösung)	Wisent	311425125
ECM (Extrazelluläre Matrix)			Isoliert aus humanem Adipose Gewebe, Schweinedermis oder Schweinefleisch Myokard, wie in Flynn beschrieben et al. 2010, Reing et al. 2010 und Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32)
Zange	VWR	Tel.: 37-501-32	Zum Übertragen der Schäume
Gefrierschrank (-20 °C)	VWR	Tel.: 97043-346
Gefrierschrank ( -80 °C)	Thermo Scientific	EXF40086A
Fläschchen aus Glas	Fisher Scientific	03-339-26D	Zur Lagerung von lyophilisiertem kryomilled Ecm
Flüssigstickstoff			Zum Elektrospritzen
Lyophilisierer	Labconco	7750021	FreeZone4.5
18 G Nadel	VWR	C ABD305185	Zum Dosieren von ECM-Suspension in Formen
Schüttler für Orbital-Inkubator	SciLogex	832010089999	Temperaturgesteuert (37 °C)
Serologische Pipetten (10 mL)	Sarstedt	Artikel-Nr.: 86.1254.001
Serologische Pipetten (25 mL)	Sarstedt	Artikel-Nr.: 86.1685.001
Natriumchlorid	BioShop	Artikel-Nr.: 7647-14-5
Natriumphosphat einbasisch	BioShop	Artikel-Nr.: 10049-21-5