Herstellung von Biogerüsten durch Elektrospraying: Eine Technik zur Erzeugung von Microcarrier-Gerüsten, die aus der extrazellulären Matrix von dezellularisiertem Gewebe gewonnen werden

Zusammenfassung

Quelle: Kornmüller, A. et al. Herstellung von extrazellulären Matrix-abgeleiteten Schäumen und Microcarriern als gewebespezifische Zellkultur- und Verabreichungsplattformen. J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video demonstriert das Verfahren der Herstellung von Mikrocarriern aus extrazellulärer Matrix durch Elektrospraying. Diese Microcarrier simulieren die native gewebespezifische Mikroumgebung und sind in Langzeit-3D-In-vitro-Zellkulturmodellen stabil.

Protokoll

>1. ECM-abgeleitete Microcarrier-Herstellung durch Elektrospritzen

HINWEIS: Eine Übersicht über den Aufbau des Elektrospritzens ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Inkubieren Sie eine zuvor vorbereitete kryogemahlene ECM-Suspension bei 37 °C unter kontinuierlichem Rühren bei 100 U/min O/N.
   Anmerkung: Kryogefrästes ECM wird zur Herstellung der aus dem ECM abgeleiteten Microcarrier verwendet, um eine größere Gleichmäßigkeit in der Suspension zu gewährleisten und ein Verstopfen während des Elektrosprays zu verhindern.
2. Laden Sie 3 ml ECM-Suspension in eine 3-ml-Luer-Lock-Spritze und befestigen Sie ein geflügeltes Infusionsset an der Bohrung der Spritze.
   Anmerkung: Es kann eine Reihe von Nadelstärken verwendet werden, wobei zu berücksichtigen ist, dass die Auswahl die Größe und Form der resultierenden Mikrocarrier beeinflussen kann. Verwenden Sie zur Herstellung der DAT-, DDT- und DLV-Microcarrier eine 25G-Nadel.
3. Befestigen Sie die Spritze in der Spritzenpumpe. Befestigen Sie die Nadel an einem Retortenständer und positionieren Sie die Nadelspitze vertikal in einem Abstand von 4–6 cm von der Oberseite eines Dewarkolbens mit niedriger Form (empfohlener Größenbereich von 250–500 ml).
4. Befestigen Sie eine Krokodilklemmen-Elektrode an der Spitze der Nadel und verbinden Sie sie mit dem Pluspol des Hochspannungsnetzteils.
5. Falten Sie einen Streifen Alufolie (12 x 5 cm) über den Rand der Isolierflasche.
6. Befestigen Sie eine zweite Krokodilklemmen-Elektrode an der Außenkante der Folie und verbinden Sie sie mit dem Erdungsanschluss des Netzteils.
7. Der Dewarwarkolben wird ca. 1 cm von der Oberseite entfernt mit flüssigem Stickstoff gefüllt, so dass 3/4 der Folie eingetaucht ist.
   Anmerkung: Es ist wichtig, den Dewargefäß mit flüssigem Stickstoff gefüllt zu halten. Die Oberfläche des flüssigen Stickstoffs darf während des Elektrospritzvorgangs nicht weniger als 2 cm von der Oberseite des Kolbens entfernt sein. Ein kontinuierliches Nachfüllen des flüssigen Stickstoffs ist erforderlich, um während des Elektrospritzens ein konstantes Niveau zu halten.
8. Stellen Sie die Spritzenpumpe auf eine Infusionsrate von 30 mL/h ein.
   Anmerkung: Eine Variation der Infusionsrate kann die Form und den Durchmesser des Microcarriers verändern, aber der empfohlene Bereich liegt bei 25–35 ml/h. Obwohl es stark von der Viskosität der Suspension abhängt, können Flussraten unter 25 mL/h zur Bildung größerer Microcarrier führen. Bei sehr niedrigen Durchflussraten können Größe und Form der Microcarrier weniger homogen werden. Bei Infusionsraten über 35 mL/h kann die Gleichmäßigkeit der durch Elektrospraying erzeugten Tröpfchen gestört werden, was zu nicht-sphärischen Mikrocarriern mit einer breiteren Größenverteilung führt.
9. Legen Sie eine Spannung von 20 kV an und schalten Sie die Spritzenpumpe ein, um das Elektrospritzen zu starten.
   Anmerkung: Die Spannung kann variiert werden, um die Größe der Microcarrier abzustimmen, und hat tendenziell einen größeren Einfluss auf den Durchmesser als die Infusionsrate. Der empfohlene Spannungsbereich liegt bei 15–25 kV. Mit zunehmender Spannung wird eine Abnahme des Mikroträgerdurchmessers erwartet.
10. Sobald die Infusion abgeschlossen ist, gießen Sie überschüssigen flüssigen Stickstoff vorsichtig aus dem Dewar ab und lassen Sie die Mikroträger in ~25 mL flüssigem Stickstoff suspendiert, um sicherzustellen, dass sie gefroren bleiben.
11. Übertragen Sie die Microcarrier mit dem flüssigen Stickstoff sofort in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen, indem Sie in einer gleichmäßigen Bewegung gießen. Sammeln Sie alle im Dewar verbliebenen gefrorenen Microcarrier mit einer Schöbel und geben Sie sie in das Zentrifugenröhrchen.
    Anmerkung: Je nach Größe des Dewars können die Microcarrier in flüssigem Stickstoff zunächst in ein mittelgroßes Gefäß gegossen und dann sofort in das 50 mL Zentrifugenröhrchen überführt werden.
12. Decken Sie das Zentrifugenröhrchen mit den Mikrocarriern in flüssigem Stickstoff mit Aluminiumfolie ab, die mit kleinen Löchern perforiert ist, um die Gefriertrocknung vorzubereiten.
13. Legen Sie die abgedeckten Zentrifugenröhrchen in einen Lyophilisatorkolben. Den Kolben sofort an den Gefriertrockner anschließen und die Proben O/N.
    trocknen Anmerkung: Es ist sehr wichtig, die Microcarrier in flüssigem Stickstoff suspendiert zu halten, um sicherzustellen, dass sie vor diesem Schritt nicht auftauen, da das Auftauen zu einem Kollaps und/oder einer Aggregation führen kann. DAT-, DDT- und DLV-Mikrocarrier, die in einer Konzentration von 35 mg/ml unter den oben beschriebenen Elektrospray-Bedingungen hergestellt werden, haben in der Regel einen hydratisierten Durchmesser zwischen 350 und 500 μm in der Größe. Die Größenverteilung kann je nach ECM-Quelle variieren.
14. Lagern Sie die lyophilisierten Microcarrier bis zur Verwendung in einem Exsikkator.

Ergebnisse

Abbildung 1. Überblick über die Elektrospray-Geräte, die bei der Herstellung von Mikrocarriern verwendet werden. A: Bild, das die Anordnung der wichtigsten Elektrospray-Geräte einschließlich der Spritzenpumpe und der Hochspannungsstromversorgung sowie die Positionierung der Nadel relativ zum Dewar von flüssigem Stickstoff zeigt. B: Elektrospray-Schema, einschließlich d...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Leinen aus Krokodilklemme	VWR	Artikel-Nr.: 470149-728
Alufolie	Fisher Scientific	Tel.: 01-213-101
Zentrifugenröhrchen (15 mL)	Sarstedt	Artikel-Nr.: 62.554.205
Zentrifugenröhrchen (50 mL)	Sarstedt	Artikel-Nr.: 62.547.205
Exsikkator	Fisher Scientific	8624426	Für die Lagerung von lyophilisierter EZM und Biogerüsten
Dewargefäß	Fisher Scientific	Artikel-Nr.: 10-196-6	Niedrige Form; Volumenbereich von 250 - 500 mL
ECM (Extrazelluläre Matrix)			Isoliert aus menschlichem Fettgewebe, Schweinedermis oder Schweinemyokard, wie in Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010 und Wainwright et al. 2010 beschrieben (Ref # 28, 8, 32)
Flüssigstickstoff			Zum Elektrospritzen
Lyophilisierer	Labconco	7750021	FreeZone4.5
Schüttler für Orbital-Inkubator	SciLogex	8.3201E+11	Temperaturgesteuert (37 °C)
Retortenständer	VWR	Tel.: 470019-526
Klemme für Retortenständer	VWR	Tel.: 21573-606
Safety-Lok Spritze	Bd	309606	3 mL Luer-Lock-Spritze für die Herstellung von Microcarriern und die Abgabe von ECM-Suspensionen
Scoopula	VWR	Tel.: 89259-968	Zum Sammeln von Microcarriern
Spritzenpumpe	VWR	Tel.: 10117-490	Mikroprozessorgesteuert
Hochspannungs-Stromversorgung	Gamma-Hochspannungsforschung	ES30P-5W/DDPM	Geeignet für den empfohlenen Spannungsbereich von 15 bis 25 kV
Geflügeltes Infusionsset	Terumo	22258092	30 cm Schlauchlänge, empfohlen 25 G 3/4"; Andere Nadelstärken können verwendet werden und können den Durchmesser des Mikroträgers beeinflussen