Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereitung von halbfesten Matrixtröpfchen (< 1 min pro Platte)
- Legen Sie eine vorgekühlte Glasschachtbodenplatte auf einen Eisblock unter dem Operationsmikroskop. Stellen Sie sicher, dass das Aliquot der Matrix immer auf dem Eis bleibt.
- Geben Sie mit einer 2 μl oder 10 μl Mikropipette ein 1,5 μl großes Tröpfchen Matrix in jede der vier Ecken der Glasbodenplatte, wobei ein Abstand zum Rand der Glasvertiefung mindestens so groß ist wie der Abstand des Tröpfchens selbst.
- Setzen Sie die Spitze der Pipette in einem Winkel von 45 Grad direkt auf das Glas auf. Pipettieren Sie die Matrize langsam. Bewegen Sie sich langsam vom Glasboden weg, nachdem die Matrize auf der Platte eingerastet ist.
Anmerkung: Durch die Oberflächenspannung zwischen Matrix und Glas soll jedes Mal eine perfekte Halbkugel entstehen.
- Beenden Sie das Pipettieren, kurz bevor die Spitze leer ist, da die versehentliche Injektion von Luft in den Matrixtröpfchen den Durchmesser des Matrizhütchens erheblich vergrößert und schwer zu entfernen ist.
Anmerkung: Die Verwendung einer zweiten Hand zur Stabilisierung der Pipettierhand ermöglicht eine genauere Platzierung.
>2. Einbringen von DRG in halbfeste Matrixtröpfchen (< 2 min pro Platte)
- Lassen Sie die Platte mit den Matrixtröpfchen kurz bei Raumtemperatur (~1 min). Dadurch wird die Matrix leicht versteift, was das präzise Platzieren des DRG erleichtert.
- Schöpfen Sie die DRG vorsichtig mit einer geschlossenen mikroskopisch kleinen Pinzette in der linken Hand (fassen Sie sie nicht an). Auch hier erleichtert ein dunkler Hintergrund vor dem kleinen, weißen DRG die Visualisierung. Übertragen Sie das DRG auf die Spitze einer 21G-Nadel in der rechten Hand. Bei dieser Übertragung bleiben Medienreste auf der Pinzette zurück.
- Führen Sie das DRG mit der 21G-Nadel vorsichtig in die Mitte des Matrixtröpfchens ein (Abbildung 1). In den meisten Fällen löst sich das DRG leicht in die Matrize und kann dann mit der Nadel mittig positioniert werden.
- Wenn das DRG an der Nadel klebt, drücken Sie das DRG mit der mikroskopisch kleinen Pinzette von der Nadel in das Matrixtröpfchen. Entfernen Sie überschüssiges Medium von der mikroskopisch kleinen Pinzette mit einem Labortuch.
Anmerkung: Das Einbringen von Medien in die Matrix verändert den Durchmesser, das Volumen und die Konsistenz des Assays. Ein Eisblock mit Farbe oder farbiger Schrift sorgt für einen Hintergrundkontrast, der die Visualisierung dieses heiklen Prozesses erleichtert.
- Nachdem die Platte alle vier DRGs aufweist, führen Sie eine Endkontrolle durch, um sicherzustellen, dass sich das DRG in der Mitte des Matrixtropfens befindet. Nehmen Sie mit der 21G-Nadel nach Bedarf Anpassungen vor.
- Übertragen Sie die fertige Platte in einen 37 °C heißen Inkubator. Dadurch wird die halbfeste Matrix verfestigt und das DRG in Position fixiert.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle DRGs. Platzieren Sie leere Matrixtröpfchen ohne DRG als Negativkontrolle.
- Geben Sie 4 mL DMEM mit 10 % FBS-Medium auf jede Glasbodenplatte, nachdem Sie alle Platten fertiggestellt und mindestens 3 Minuten lang dem 37 °C heißen Inkubator ausgesetzt haben. Stellen Sie die Platte leicht schräg auf und fügen Sie das Medium langsam hinzu, so dass es allmählich mit den Matrix-DRG-Einheiten in Kontakt kommt.
Anmerkung: Wenn das Medium zu schnell oder zu kräftig zugegeben wird, kann sich die Matrix und/oder DRG lösen.
- Lagern Sie die Assays im 37 °C Inkubator für die nächsten 48–72 h.
Anmerkung: Die periodische Untersuchung der Assays zeigt ein umlaufendes Auswachsen von Neuriten in Richtung des Matrixrandes (Abbildung 2). Wenn die Neuriten mehr als drei Viertel des Weges zur Matrix zurückgelegt haben, ist es angebracht, die Zellen zu plattieren.
>3. Präparation der Kopf- und Halskrebszellen
HINWEIS: Andere Zelllinien als Plattenepithelkarzinomzellen im Kopf- und Halsbereich können in diesem Versuchsdesign verwendet werden.
- Bewahren Sie Plattenepithelkarzinom-Zelllinien in DMEM mit 10 % FBS in bevorzugten Kolben oder Kulturschalen in einem 37 °C-Inkubator auf. Um die Zellen für die Experimente vorzubereiten, saugen Sie das gesamte Medium aus dem Kulturkolben oder der Schale ab und waschen Sie es zweimal mit PBS. Suspendieren Sie die Zellen, indem Sie 5 Minuten lang eine angemessene Menge von 0,025 % Trypsin hinzufügen, gefolgt von DMEM mit 10 % FBS. 4 ml des Zell-Medien-Gemisches werden in 6 ml-Kulturschalen pipettiert.
Anmerkung: Eine 6-ml-Kulturplatte liefert mehr als genug Zellen, selbst wenn weniger als 50 % konfluierend sind.
- Setzen Sie die HNSCC-Zelllinien 24 Stunden vor der Färbung und Plattierung auf dem DRG-Assay verschiedenen Bedingungen aus. Dosieren Sie die Bedingung erneut, sobald die Zellen plattiert sind, um eine konsistente Umgebung aufrechtzuerhalten.
Anmerkung: Geben Sie Antikörper, Wachstumsfaktoren, Zytokine oder andere Moleküle 1–2 Tage nach der Mausdissektion und der Implantation des DRG in die Matrix in die Zellkulturschalen.
- 1 h vor dem Plattieren der Zellen (2–3 Tage nach der DRG-Ernte und der Implantation in die Matrix) fluoreszierende Zellfärbungen zugeben).
Anmerkung: Die hier verwendeten Färbungen dringen ungehindert durch die Zellmembran; Nach der Reaktion mit intrazellulären Thiolgruppen verbleibt der Farbstoff jedoch in der Zelle und wird an Tochterzellen weitergegeben. Die Färbung erleichtert die Visualisierung innerhalb der Assays erheblich. Diese temporären Färbungen sind ideal für diese Assays, da die Fluoreszenz 2-3 Tage lang vorhanden ist, was dem Zeitrahmen dieser Experimente entspricht. Es ermöglicht auch die Verwendung vieler verschiedener Farben und macht die Herstellung von fluoreszierenden Protein-transfizierten Zelllinien überflüssig.
- Bereiten Sie 10 μM Farbstofflösung vor, indem Sie 2 μl 10 mM Stammzellfärbungen in 2 ml serumfreiem DMEM für jeden Zellzustand mischen. Erwärmen Sie es auf 37 °C, bevor Sie es in die Zellen geben.
- Entfernen Sie das Kulturmedium aus der 6-ml-Platte, und lassen Sie die adhärenten HNSCC-Zellen auf der Platte. Fügen Sie 2 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) hinzu und entfernen Sie 2 ml des 10 μM Zellfleck-/serumfreien DMEM, das auf jede Platte gegeben wurde.
- Stellen Sie die 6-ml-Kulturplatte mit dem Zellfleck für 40 min in den 37 °C-Inkubator zurück.
- Nach 40 min das Medium ansaugen. Fügen Sie 2 ml PBS hinzu und aspirieren Sie es. Geben Sie 1 ml 0,025 % Trypsin in jede Platte und setzen Sie sie wieder in den 37 °C-Inkubator ein.
- Fügen Sie nach 3–5 Minuten 2 mL DMEM mit 10 % FBS hinzu und überführen Sie die suspendierten Zellen in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Spinieren Sie die Zellen und resuspendieren Sie sie in 1 mL DMEM mit 10% FBS.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler und fügen Sie dann DMEM mit 10 % FBS hinzu, um eine endgültige Zellkonzentration von 300.000 Zellen pro ml zu erreichen.
>4. Plattierung von Kopf- und Halskrebszellen
- Entnehmen Sie die Glasbodenplatten mit den Matrix-DRG-Assays aus dem Inkubator.
Anmerkung: Auch hier sind sie angebracht, wenn die Neuriten mindestens 75% des Weges zum Rand der Matrix zurückgelegt haben, was in der Regel nach 2-3 Tagen der Fall ist. Dies lässt sich am besten mit mindestens einem 10-fachen Objektiv erkennen.
- Saugen Sie das Medium in der Glasbodenplatte an. Saugen Sie das Medium vollständig innerhalb der Glasmulde an, ohne die Matrix-DRG-Einheiten zu entfernen.
- Ziehen Sie 200 μl des 300.000 Zellen/ml-Mediums mit einer 200-μl-Pipette auf. Geben Sie zwei Tropfen der Zellen auf jeden Matrix-DRG-Assay. Führen Sie diesen Schritt für jedes Matrixtröpfchen aus, indem Sie vier Wiederholungen jeder Zellbedingung auf einer Platte erstellen.
Anmerkung: Die halbkugelförmige Form der Matrix ermöglicht es den Zellen, sich in einem Ring entlang der Peripherie des Assays anzusiedeln (Abbildung 3a, Abbildung 3b). Die Suche nach einer Pipette mit einem glatten Abzug erleichtert das Platzieren gleichmäßiger Tropfen erheblich.
- Bestätigen Sie ähnliche Zellzahlen und die Verteilung der verschiedenen Zellbedingungen unter 4X-Mikroskopie.
- Legen Sie die Glasbodenplatten für ca. 60 Min. in den 37 °C heißen Inkubator
Anmerkung: Obwohl nur ein geringes Volumen an Zellen und Medien (~150 μL) vorhanden ist, trocknen die Assays erst nach Ablauf mehrerer Stunden Inkubatorzeit aus.
- Nach 60 min geben Sie vorsichtig 4 mL DMEM mit 10 % FBS entlang der Seitenwand der Glasbodenplatte.
Anmerkung: Im Laufe der Zeit haften die Zellen teilweise am Plattenboden an, und die Art der Zugabe des Mediums stört die Zellen nicht. Unterschiedliche Zelltypen können mehr oder weniger Zeit benötigen, um an der Glasbodenplatte zu haften.
- Ersetzen Sie zu diesem Zeitpunkt alle exogenen Arzneimittel oder Wachstumsfaktoren, um die vorherigen Konzentrationswerte beizubehalten.
- Die Assays werden wieder in den 37 °C-Inkubator gestellt, es sei denn, sie werden mikroskopisch untersucht. Quantifizieren Sie die Ergebnisse dieses Assays durch mikroskopische Bildgebung. Zählen Sie kurz gesagt die Stränge der perineuralen Invasion innerhalb von vier Quadranten mit einem 4-fachen mikroskopischen Bild.
Anmerkung: Ein Mikroskop mit einem 4X-Objektiv und Fluoreszenzfunktionen ist ausreichend für die Fotodokumentation der Assays. Die Größe der Assays passt gut in den Bereich eines 4X-Objektivs, das detailliert genug ist, um die einzelnen Bereiche der perineuralen Invasion zu erfassen. Eine perineurale Invasion wird innerhalb von 24 Stunden sichtbar, aber nach 48 Stunden beginnt die Integrität der Assays zu schwächen, da sich die Tumorzellen entlang der Peripherie der Matrix teilen und eindringen. Jenseits von 48 h kommt es auch zu einem erheblichen Ausfluss von Fibroblasten aus dem DRG, was die Visualisierung mit Hilfe der Hellfeldmikroskopie verschleiert. Daher ist es ratsam, die Ergebnisse mindestens zweimal in diesem Zeitfenster mit der 4X-Mikroskopie zu fotodokumentieren (z.B. 24 und 48 h nach der Beschichtung der Tumorzellen). Beachten Sie, dass es sich um 3-dimensionale Assays handelt und es schwierig ist, den gesamten Assay vollständig abzubilden. Die meisten perineuralen Invasionen finden in einer Ebene von der Unterseite der Platte statt, wo die Zellen etwas oberhalb der Unterseite der Platte in die Matrix eingebettet sind. Da diese Ebene nahezu horizontal ist, wird die überwiegende Mehrheit der Neuriten mit Tumorzellen in einem einstufigen Bild mit 4X erfasst.
