>1. Selektion einer Seitenpopulation (SP) durch den Hoechst Farbstoff-Efflux-Assay
- Färbung von 50 Millionen Zellen mit dem Farbstoff Hoechst 33342
- Bereiten Sie zwei sterile 15-ml-Röhrchen mit konischem Boden vor: ein Röhrchen mit der Bezeichnung "Hoechst" und das andere mit der Bezeichnung "Hoechst und Verapamil". Bereiten Sie 10 ml 5 mM Verapamilhydrochloridlösung in sterilem Wasser vor. Bereiten Sie das Kulturmedium (CM) für die Stammzellen vor.
- Zur Vorbereitung von CM für CSC (CM-CSC) kombinieren Sie Folgendes: Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM): F12 (1:3, v:v), 5 % fötales Kälberserum (FCS), 0,04 mg/l Hydrocortison, 100 U/ml Penicillin, 0,1 g/l Streptomycin und 20 μg/l epidermaler Wachstumsfaktor (EGFR).
- Unter einer Laminar-Flow-Haube trypsinisieren Zellen. Entfernen Sie das Medium, waschen Sie es mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und fügen Sie 1 ml Trypsin-EDTA (0,5 g/l) für einen 75 cm² Kolben hinzu. 3 min bei 37 °C inkubieren. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie ein Kulturmedium hinzufügen, das für die elterliche Zelllinie verwendet wird. Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Zellzähler.
- Um CM für die elterliche Zelllinie (CM-P) vorzubereiten, ergänzen Sie DMEM mit 10 % FCS, 0,4 mg/l Hydrocortison, 100 U/ml Penicillin und 0,1 g/l Streptomycin).
- Die in Schritt 1.1.2 erhaltene Zellsuspension wird auf 107 Zellen/ml CM-P verdünnt. Teilen Sie die Zellsuspension in die beiden vorbereiteten Röhrchen auf: Geben Sie 100 μL (106 Zellen) in das Röhrchen "Hoechst und Verapamil" und 4 mL (4 x 107 Zellen) in das Röhrchen "Hoechst".
- In die Probe "Hoechst und Verapamil" werden 10 μl 5 mM Verapamilhydrochloridlösung (Endkonzentration: 0,5 mM) zugegeben und vorsichtig gemischt. 5 μl 1 g/l Hoechst-Lösung (Endkonzentration: 0,1 g/l) zugeben. In die Probe "Hoechst" werden 5 μl 1 g/l Hoechst-Lösung pro 106 Zellen (insgesamt 200 μl) gegeben. Bewahren Sie die Proben von nun an mit Aluminiumfolie vor direkter Lichteinwirkung auf.
- Alle Röhrchen in einem Wasserbad bei 37 °C für 1 h 30 min inkubieren. Alle 15 min vorsichtig mischen, um ein Absetzen der Zellen zu verhindern.
- Zentrifugenröhrchen bei 250 x g für 5 min bei 4 °C. Überstand entfernen und jedes Pellet mit 2 mL 1x PBS resuspendieren.
- Die Röhrchen bei 250 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Überstand entfernen. Das "Hoechst and Verapamil"-Pellet in 500 μl 5 mg/l Propidiumiodid (PI), verdünnt in PBS-Puffer, und das "Hoechst"-Pellet in 4 mL mit 5 mg/l PI, verdünnt in PBS-Puffer, resuspendieren.
- Übertragen Sie Probenlösungen durch ein 70-μm-Zellsieb, um Aggregate zu entfernen und einzelne Zellen in Röhrchen für die Probenaufnahme auf dem Durchflusszytometer zu sammeln. Bewahren Sie die Proben auf Eis auf und schützen Sie sie mit Aluminiumfolie vor direkter Lichteinwirkung.
>2. Isolierung der Seitenpopulation ohne Hoechst-Farbstoff durch Zellsortierung
- Führen Sie die negative Hoechst-Zelltrennung auf einem Durchflusszytometrie-Sortierer mit den folgenden Parametern durch: UV-Laser (355 nm), zwei Detektoren auf dem UV-Laserpfad mit blauen Hoechst- (450/50 BP) und roten Hoechst-Filtern (610/20 BP) und zwei Kollektoren.
- Analysieren Sie zunächst die Probe "Hoechst", die als Positivkontrolle für die Färbung und den Aufbau des Durchflusszytometers dient.
- Klicken Sie mit der Zytometer-Software im Fenster "Globales Arbeitsblatt" auf "Punktdiagramm" (fünftes Bild oben rechts) und erstellen Sie ein Diagramm auf dem globalen Arbeitsblatt. Wählen Sie auf der Ordinate mit einem Rechtsklick FSC-A (Vorwärtsstreuung) und auf Abszissa SSC-A (Seitenstreuung) (Abbildung 1A). Erstellen Sie auf die gleiche Weise ein Punktdiagramm für SSC-W und SCC-H. Um in diesem zweiten Punktdiagramm einen P1-Bereich zu erstellen, klicken Sie auf "Polygon-Gate" (vierzehntes Bild oben rechts) (Abbildung 1B).
Anmerkung: Die P1-Region umfasst einzelne Zellen und diskriminierende Dubletten.
- Optional: Schließen Sie PI-positive Zellen aus, indem Sie ein FSC-A- und PI-Gated auf P1 erstellen. Wählen Sie in diesem Punktdiagramm die PI-negative Population (P2) aus, um PI-positive tote Zellen auszuschließen.
- Klicken Sie mit der Zytometer-Software im Fenster "Globales Arbeitsblatt" auf "Punktdiagramm" und erstellen Sie ein Diagramm auf dem globalen Arbeitsblatt. Wählen Sie auf der Ordinate mit einem Rechtsklick den blauen Hoechst-A und auf der Abszisse den roten Hoechst-A. Mit einem Rechtsklick auf die Grundgesamtheit wählen Sie "Grundgesamtheit anzeigen" und P1. Erstellen Sie in diesem Punktdiagramm einen Bereich (P2), um die negativen Zellen der Hoechst-Farbstoffseitenpopulation (SP) auszuwählen, die als Seitenarm links von der Hauptpopulation von Zellen angezeigt werden (Abbildung 1C).
- Analysieren Sie die Stichprobe "Hoechst" und sammeln Sie 10.000 Ereignisse. Um sicherzustellen, dass das Gate P2, das die SP-Population repräsentiert, gut positioniert ist, analysieren Sie die Stichprobe "Hoechst und Verapamil" (10.000 Ereignisse), um das Verschwinden der SP-Population zu beobachten (Abbildung 1D).
- Die negativen Zellen des SP Hoechst-Farbstoffs werden in einem 15-ml-Röhrchen mit 1 ml CM-CSC gesammelt, das in Schritt 1.1.1 hergestellt wurde.
- Am Ende der Zellsortierung zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 250 x g für 5 min, entfernen den Überstand und resuspendieren das Pellet mit 1 mL CM-CSC. Die Anzahl der sortierten Zellen wird mit einem Zellzähler gezählt und eine entsprechende Anzahl von Zellen in einen Kulturkolben überführt (siehe Tabelle 1). CM-CSC zugeben und bei 37 °C und 5 % CO2 -Atmosphäre inkubieren.
- Halten Sie die Zellen unter den gleichen Bedingungen für maximal zwei Durchgänge in Kultur, bis mindestens 5 x 107 Zellen vorhanden sind.
Tabelle 1: Typ des Kulturkolbens, der in Abhängigkeit von der Anzahl der sortierten Zellen zu verwenden ist. Angaben zur Größe des Kulturkolbens für eine ungefähre Anzahl der sortierten Zellen sind angegeben. Das für den Kulturkolbentyp erforderliche Trypsinvolumen und das Volumen des Mediums sind ebenfalls angegeben.
kg
| Anzahl der sortierten Zellen | Typ Kulturflasche | Trypsin-Volumen (ml) | Volumen des Kulturmediums (ml) |
| 10.000-200.000 | 1 Mulde einer 6-Well-Platte oder einer 3,5 cm Petrischale | 0,5 | arabische Ziffer |
| 200.000 bis 1.000.000 | 1 Kulturflasche T25 | 1 | 4 |
| 1.000.000 > | 1 Kulturflasche T75 | arabische Ziffer | 10 |
