>1. MTT-Assay für leukämische Zellen
- Bereiten Sie die MTT-Lösung im Voraus vor: 500 mg MTT-Formazan in 10 mL PBS auflösen und (lichtgeschützt) mit einem Magnetrührer ca. 1 h lang umrühren. Die Lösung mit einem 0,22 μm Filter sterilisieren.
Anmerkung: Die Lösung kann in 10-ml-Aliquoten bei -20 °C gelagert werden. Nach dem Auftauen vor direktem Licht schützen.
- Bereiten Sie im Voraus das angesäuerte Isopropanol vor: Fügen Sie 50 mL von 2 M HCl zu 2,5 L Isopropanol hinzu.
Anmerkung: Lagern Sie die Lösung vor Gebrauch mindestens einen Monat lang bei Raumtemperatur. Wenn das Isopropanol nicht korrekt angesäuert wird, kann es mit dem Medium Ausfällungen bilden und die spektrophotometrische Anzeige beeinträchtigen.
- Bereiten Sie eine separate 96-Well-Platte mit flachem Boden "Tag 0" (Kontrollplatte) vor, um eine genauere Abschätzung der Wachstumshemmung zu gewährleisten: Widmen Sie 3 bis 6 Wells pro Zelllinie, fügen Sie 30 μl Wachstumsmedium und 120 μl Zellsuspension (8.000 Zellen) pro Well und 150 μl Wachstumsmedium in Vertiefungen hinzu, die den Rohlingen (keine Zellen) entsprechen. Fahren Sie mit Schritt 1.9 bis Schritt 1.13 dieses Abschnitts fort, um die optische Dichte (OD) zu messen.
- Bereiten Sie eine 96-Well-Versuchsplatte mit flachem Boden vor: Widmen Sie 30 Wells für Arzneimittelkonzentrationen (10 Konzentrationen, jeweils in dreifacher Ausfertigung), 10 Wells für die Kontrolle von Zellen und 10 Wells für die Kontrolle des Mediums ohne Zellen (Leerproben) und bereiten Sie einen Wirkstoffverdünnungsbereich von Dexamethason (Dex) unter Verwendung von Dimethylsulfoxid als Lösungsmittel vor.
Anmerkung: Für CEM-WT-Zellen liegt der Dex-Verdünnungsbereich zwischen 2 μM und 0,97 nM. Für CEM/R30dm-, CEM-R5- und CEM-C3-Zellen liegt der Dex-Verdünnungsbereich zwischen 640 μM und 0,33 nM.
- Geben Sie 30 μl aus jeder Dex-Verdünnung in eine geeignete Vertiefung der 96-Well-Platte. Stellen Sie sicher, dass Sie jede Konzentration in dreifacher Ausfertigung angeben.
- 30 μl Wachstumsmedium werden in die Vertiefungen für die Kontrollzellen und 150 μl Wachstumsmedium in die Vertiefungen für die Rohlinge gegeben.
- Ernten Sie exponentiell wachsende Zellen und resuspendieren Sie sie bei optimaler Aussaatkonzentration.
Anmerkung: Um die optimalen Ausgangszellkonzentrationen zu bestimmen, wird empfohlen, das Wachstumsprofil jeder Zelllinie in einer 96-Well-Platte zu beurteilen, indem Zellen in mehreren Konzentrationen ausgesät und mindestens 4 Tage lang täglich gemessen werden. Wählen Sie eine Aussaatkonzentration, die ein Überwachsen der Zellen nach 72 h verhindert, da dies das Experiment beeinflusst, indem die OD-Werte gesättigt werden. Für CEM-WT, CEM-C5 und CEM-R5 beträgt die optimale Seeding-Konzentration 8.000 Zellen/Well, während sie für CEM/R30dm 5.000 Zellen/Well beträgt.
- Geben Sie 120 μl der Zellsuspension in jede Vertiefung, die entweder die Arzneimittellösung oder das Wachstumsmedium enthält (Vertiefungen, die den Kontrollzellen entsprechen). Füllen Sie die leeren äußeren Vertiefungen der Platte mit 150 μL PBS, um eine gute Luftfeuchtigkeit in der Platte zu gewährleisten, und inkubieren Sie die Platten für 72 h bei 37 °C mit 5% CO₂ in einem Zellkultur-Inkubator.
- Geben Sie 15 μl der MTT-Lösung in jede Vertiefung und schütteln Sie die Platte 5 Minuten lang mit einem Plattenschüttler bis zu einem Maximum von 900 Schütteln/min.
- Stellen Sie die Platten wieder bei 37 °C mit 5 % CO₂ in einen Zellkultur-Inkubator und inkubieren Sie weitere 4–6 h.
- Geben Sie 150 μl des angesäuerten Isopropanols in jede Vertiefung und mischen Sie die Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette, um alle Formazankristalle gründlich zu resuspendieren. Beginnen Sie mit den leeren Vertiefungen und spülen Sie die Spitzen gut aus, bevor Sie mit einer anderen Reihe der Platte fortfahren.
- Inkubieren Sie die Platte 10 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT).
- Bestimmen Sie mit einem Mikroplatten-Reader den OD bei 540 und 720 nm, um eine genaue Messung durch Korrektur des Hintergrund-OD zu gewährleisten. Speichern Sie dann die Daten in einer Tabellenkalkulationsdatei und analysieren Sie sie.
>2. Datenanalyse für den MTT-Assay
- Berechnen Sie die ABV-Werte von Zellen an "Tag 0" mit der folgenden Formel:
ODTag 0 =OD Kontrollzellen - Durchschnittliche ODBlank Wells
- Berechnen Sie den Prozentsatz der überlebenden Zellen für jede Arzneimittelkonzentration nach der folgenden Formel:
% Behandelte Zellen = Durchschnittlich [ODbehandelte Zellen - Durchschnittliche ODBlank Wells - ODTag 0]/[OD Kontrollzellen - Durchschnittliche ODBlank Wells - ODTag0]*100
- Darstellung der Dosis-Wirkungs-Kurve (Wirkstoffkonzentration vs. Wachstumshemmung in %).
- Berechnen Sie die Konzentration des Arzneimittels, das das Wachstum von Zellen um 50% (IC50) hemmt, anhand der Dosis-Wirkungs-Kurve.
