>1. Vorbereitung der Materialien
- Deckgläser für Autoklaven
- Legen Sie die Deckgläser in ein Becherglas.
- Decken Sie den Glasbecher mit Folie ab.
- Autoklav bei 121 °C bei 15 psi für 20 min.
- Bei 50 °C trocknen. Bei Raumtemperatur in einer Kulturhaube lagern.
- Bereiten Sie die Fixierlösung vor: 3 % Paraformaldehyd + 2 % Saccharose in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)
- In eine 1.000-ml-Glasflasche geben Sie 700 mL PBS und 30 g Paraformaldehyd.
Vorsicht: Paraformaldehyd ist ätzend, tragen Sie geeignete Handschuhe.
- Paraformaldehyd durch Erhitzen auf 80 °C in der Mikrowelle vollständig auflösen.
Vorsicht: Paraformaldehyd-Dämpfe sind giftig, tragen Sie eine Maske.
- Über Nacht bei Raumtemperatur ruhen lassen.
- 20 g Saccharose hinzufügen.
- Fügen Sie PBS hinzu, um das Gesamtvolumen auf 1 L zu erhöhen.
- Aliquot in 50-ml-Röhrchen. Die Fixierlösung kann 3 Jahre bei -20 °C oder 3 Monate bei 4 °C gelagert werden.
>2. Bestrahlung
ACHTUNG: Behandeln Sie den Röntgenstrahler vorsichtig gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Untersuchen Sie die Zellen unter einem Inversphasenmikroskop. Vergewissern Sie sich, dass die Zellen am Deckglas befestigt und lebendig sind.
- Bestrahlen Sie die Schüssel mit 6 Gy Röntgenstrahlen (1,4 Gy/min, 300 KVP, 20 mA).
- 72 h bei 37 °C in einer Atmosphäre mit 5 % CO2,
inkubieren
Anmerkung: Die Inkubationszeit kann je nach Versuchsplan geändert werden
>3. Fixierung
- Nährmedien aus der Schale aspirieren.
- Schneiden Sie mit einer Schere die Spitze einer 1.000-μl-Mikropipettenspitze 5 mm vom Ende entfernt ab.
Anmerkung: Die Schnittspitze hilft, die Fixierlösung sanft aufzutragen.
- Geben Sie mit der Schneidespitze 1 ml Fixierlösung (zubereitet in Schritt 1.2) von der Seitenwand der Schale in die Schale.
Anmerkung: Dieser Schritt ist zeitkritisch und sollte daher bei der Handhabung mehrerer Proben ohne Wechsel der Mikropipettenspitzen durchgeführt werden. Das Auftragen der Fixierlösung direkt auf den Boden der Schale kann die Zellen schädigen.
- Legen Sie die Schale in eine quadratische Kulturschale. Schütteln Sie die quadratische Kulturschale vorsichtig, um die Fixierlösung gleichmäßig auf dem Deckglas zu verteilen.
- 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Fixierungslösung aus der Schale aspirieren.
- Geben Sie 2 ml PBS von der Seitenwand der Schale in die Schale.
Anmerkung: Das Auftragen von PBS direkt auf den Boden der Schale kann die Zellen schädigen.
- Aspirieren Sie PBS aus der Schale.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.7 und 3.8 zweimal.
Anmerkung: Die Schale kann 1 Woche bei 4 °C gelagert werden, wobei die Deckgläser in 2 mL PBS gebadet sind.
>4. DAPI-Färbung
- Tragen Sie 5 μl 1 μg/ml DAPI-Färbereagenz auf einen Objektträger auf.
Anmerkung: Das DAPI-Färbereagenz ist 6 Monate lang stabil, wenn es lichtgeschützt bei oder unter -20 °C gelagert wird.
- Entfernen Sie mit einem Skalpell das Deckglas von der Schale.
- Ziehe das überschüssige PBS auf dem Deckglas ab, indem du den Rand des Deckglases mit einem Papiertuch berührst.
- Montieren Sie das Deckglas kopfüber auf den Tropfen des DAPI-Färbereagenzes auf dem Objektträger, so dass die Zellen dem DAPI-Färbereagenz ausgesetzt sind.
Anmerkung: Dieser Schritt ist zeitkritisch. Das Trocknen des DAPI-Färbereagenzes kann zu einer suboptimalen Färbung führen.
- Die Proben können 1 Jahr bei -20 °C gelagert werden.
