Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereitung eines dezellularisierten Ösophagusgerüsts
- Gewinnen Sie in einem Schlachthof intakte Schweineösophagi von frisch geschlachteten Landrassenschweinen, die für die Lebensmittelproduktion verwendet werden. Eine einzige Speiseröhre bietet ausreichend Gerüste für ca. 30 separate Konstrukte.
Anmerkung: Aufgrund des umfangreichen und zeitaufwändigen Sterilisationsprotokolls lohnt es sich normalerweise, mindestens 10 Speiseröhren auf einmal zu entnehmen und zu verarbeiten.
- Legen Sie die frisch exzidierte Speiseröhre sofort für 5 Minuten in einen sterilen 180-ml-Topf mit ca. 150 ml 10%iger Povidon-Jod-Lösung, um eine kontaminierende mikrobielle Belastung zu reduzieren. Übertragen Sie die Speiseröhre in einen zweiten Topf mit ca. 100 ml sterilem PBS mit 200 I.E./ml Penicillin, 200 μg/ml Streptomycin und 1,25 μg/ml Amphotericin B.
- Setzen Sie den Deckel des Behälters wieder auf und transportieren Sie die Speiseröhre bei Raumtemperatur zurück ins Labor. Je nach Größe können zwei oder drei Speiseröhren in jedem Behälter transportiert werden.
- Im Labor angekommen, behandeln Sie das Gewebe in einer Laminar-Flow-Haube mit aseptischer Technik, um die mikrobielle Kontamination zu minimieren. Sterilisieren Sie Pinzetten, Scheren und Skalpellklingen, indem Sie sie 5 Minuten lang in 70 % Ethanol einweichen und in sterilem PBS abspülen.
- Behandle die Speiseröhre mit einer sterilen Pinzette. Schneiden Sie die Speiseröhre mit der Schere der Länge nach auf. Spülen Sie das Gewebe aus, indem Sie die Speiseröhre in einen sterilen 180-ml-Topf mit ca. 100 ml sterilem PBS legen und vorsichtig schütteln, um Ablagerungen zu entfernen.
- Reinigen Sie ein Kork-Sezierbrett, indem Sie es großzügig mit 70% Ethanol besprühen und trocknen lassen.
- Entfernen Sie die Speiseröhre aus dem PBS und stecken Sie die Speiseröhre mit sterilen Nadeln auf das Brett, wobei die Schleimhautoberfläche nach oben zeigt. Fassen Sie die Schleimhautoberfläche an einem Ende der Speiseröhre mit einer sterilen Pinzette an und ziehen Sie sie vom Brett weg. Dadurch wird die Schleimhaut von der darunterliegenden Submukosa getrennt.
- Verwenden Sie dann eine sterile Skalpellklinge, um die Speiseröhre in Längsrichtung entlang der Lamina propria zu präparieren, und entfernen Sie im Laufe der Dissektion Stifte, damit die Schleimhaut angehoben werden kann.
- Die präparierte Schleimhaut wird zurückbehalten und die darunterliegende Submukosa verworfen.
- Schneiden Sie die proximalsten und distalsten 2 cm der Schleimhaut ab und verwerfen Sie sie, da in diesen Bereichen eine größere Anzahl von submukösen Drüsen bzw. eine dickere Lamina propria vorhanden ist.
- Schneiden Sie das restliche Gewebe mit einem Skalpell in 5 cm2. Legen Sie das gesamte geschnittene Gewebe in einen sterilen 180-ml-Topf mit ca. 150 ml sterilem PBS und rühren Sie es vorsichtig um, um das Gewebe zu spülen. Wenn mehr als fünf Speiseröhren gleichzeitig bearbeitet werden, kann es erforderlich sein, für diesen und die drei folgenden Schritte mehrere Töpfe zu verwenden.
- Übertragen Sie das geschnittene Gewebe mit einer sterilen Pinzette in einen 180-ml-Topf mit 150 ml sterilem 1 M NaCl, 200 IE/ml Penicillin, 200 μg/ml Streptomycin und 1,25 μg/ml Amphotericin B. Inkubieren Sie es 72 Stunden lang bei 37 °C.
- Geben Sie das Gewebe in einen frischen 180-ml-Topf mit 150 mL sterilem PBS. Das Epithel hat begonnen, sich sichtbar vom darunter liegenden Gewebe zu lösen. Ziehen Sie das ablösende Epithel vorsichtig mit einer sterilen Pinzette aus der Speiseröhre des Schweins ab und entsorgen Sie es.
- Geben Sie das restliche Gewebe in einen frischen 180-ml-Topf und fügen Sie 150 ml steriles PBS hinzu. Zum Waschen 5 Minuten lang vorsichtig umrühren. Gießen Sie das PBS ab und wiederholen Sie es noch zwei weitere Male mit frischem PBS.
- Geben Sie das gesamte Gewebe in eine 500-ml-Glasflasche mit 400 ml steriler 80%iger (v/v) Glycerinlösung für 24 Stunden bei Raumtemperatur. Für weitere 24 Stunden in 400 ml sterile 90%ige (v/v) Glycerinlösung überführen.
- In 400 ml steriler 100%iger Glycerinlösung bei Raumtemperatur für mindestens 4 Monate lagern, um das Gewebe zu dehydrieren und zu sterilisieren, während die Integrität der Basalmembran erhalten bleibt.
