Magnetbead-basierte Exosomenextraktion: Eine Technik zur Isolierung spezifischer Exosomen aus Bioflüssigkeiten

Zusammenfassung

Quelle: Tu, M. et al. Nachweis exosomaler Biomarker durch elektrische Feld-induzierte Freisetzung und Messung (EFIRM). J. Vis. Exp. (2015)

In diesem Video demonstrieren wir ein Verfahren zur Isolierung von Exosomen aus Ziel-Bioflüssigkeiten mit magnetischen Mikrokügelchen. Das Verfahren ermöglicht die schnelle Erfassung von Exosomen, die für die nachgelagerte Analyse verwendet werden können.

Protokoll

>1. Magnetische Bead-basierte Exosomenextraktion

1. Pipettieren Sie eine gut gemischte Lösung von 5 μl Streptavidin-beschichteten magnetischen Mikropartikeln in 495 μl phosphatgepufferten Kochsalzpuffer (PBS) in ein Mikrozentrifugenröhrchen, um die Kügelchen zu resuspendieren. Waschen Sie die Kügelchen und resuspendieren Sie sie dreimal mit 500 μl PBS mit einem Magnetgestell. Das Rack ist ein Array von Magneten an der Seite einer Gehäuseeinheit, die die Proben-Mikrozentrifugenröhrchen aufnehmen können.
   1. Lassen Sie die Röhrchen bei jedem Waschgang zunächst 1 Minute auf dem Gestell ruhen und entfernen Sie dann mit einer Pipettenspitze vorsichtig den Überstandspuffer, ohne die Kügelchen zu stören.
   2. Legen Sie die Röhren auf ein normales Gestell ohne Magnete an der Seite. Geben Sie 500 μl PBS in die Röhrchen und mischen Sie mit der Pipette die Lösung und die Kügelchen miteinander. Legen Sie dann die Röhrchen wieder auf das Magnetgestell, um die Kügelchen wieder von der Lösung zu trennen.
   3. Führen Sie diese Entfernung des Puffers durch Magnetisierung und Resuspension in PBS insgesamt dreimal durch. Dadurch wird eine erste Reinigung der magnetischen Partikel durchgeführt.
2. Suspendieren Sie die Kügelchen in 490 μl PBS-Puffer, wobei das Röhrchen auf dem nicht magnetisierten Teil des Magnetgestells platziert wird. 5 μl biotinylierter Maus-Anti-Human-CD63-Antikörper in einer Stammkonzentration von 1,0 mg/ml in die Mischung der Kügelchen pipettieren. Verwenden Sie die Pipette, um die Kügelchen und den Antikörper in Lösung zu mischen.
3. Legen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Mischung aus Kügelchen und biotinylierten Antikörpern auf einen Probenrotator. Stellen Sie die Rotatorparameter für den Probenrotator auf reziproke Drehung bei 90° Neigung für 5 s und Vibration um 5° für 1 s ein. Drehen Sie die Proben-Beulen-Mischröhrchen bei diesen Parametern für 30 min bei RT.
4. Entfernen Sie den ungebundenen Antikörper nach der Konjugation.
   1. Nach 30 Minuten Drehung bei RT legen Sie die Röhren für 5 Minuten wieder in das Magnetgestell.
   2. Führen Sie drei Waschgänge von Kügelchen durch, indem Sie die flüssige Phase mit einer Mikropipette entfernen und mit 500 μl PBS waschen. Nach der dreifachen Wäsche resuspendieren Sie die Kügelchen in 490 μl Kasein-PBS und legen Sie sie auf den nicht magnetisierten Teil des Racks.
5. Exosomenextraktion mit Antikörper-beschichteten Kügelchen.
   1. Beschriften Sie jedes Röhrchen mit der Zielproben-ID. Pipettieren Sie eine 10 μl Probe Serum oder Speichel in das Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden Sie die Pipette, um die Probe und die magnetischen Kügelchen durch mehrmaliges Pipettieren zu mischen.
   2. Legen Sie die Röhrchen mit der Probe und den Anti-Human-CD63-Antikörperkügelchen auf den Rotator und drehen Sie sie 2 h lang bei RT. Verwenden Sie die gleichen Rotatorparameter wie in Schritt 1.3 beschrieben.
   3. Nach 2 Stunden Probenrotation führen Sie eine dreifache Wäsche durch, indem Sie die Kügelchen magnetisieren, um die Kügelchen von der Lösung zu trennen, die flüssige Phase mit einer Mikropipette entfernen und die Kügelchen in 500 μl Tris-HCl-Puffer resuspendieren. Die resultierenden Kügelchen werden nun an die Exosomen gebunden und sind bereit für die Freisetzung des elektrischen Feldes und die Messung.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Biotinylierter anti-humaner CD63-Antikörper	Ancell, Vereinigte Staaten von Amerika	Nr. 215-030
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Invitrogen, USA	Artikel-Nr.: 65601
Neodynium Magnetics (1/10" Durchmesser x 1/32" Dicke)	K&J Magnetics, USA	DH101
Reinstes destilliertes Wasser	Life Technologies, USA	Tel.: 10977-023
Anti-Fluorescein-POD, Fab-Fragmente	Roche, Deutschland	11426346910
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Life Technologies, USA	10010023
Kasein/PBS	Fisher Scientific, USA	Artikel-Nr.: 37532