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Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für menschliches Wohlergehen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.
>1. Verdauung von Gewebe
- Zerkleinern Sie das Gewebe mit einer 100-mm-Gewebekulturplatte mechanisch in feine Stücke mit einer Größe von ~1–2 mm mit einer autoklavensterilisierten Präparierschere und einer chirurgischen Pinzette (Abbildung 1B, C). Das Bindegewebe zwischen den Stücken sollte durchtrennt werden, um eine korrekte Trennung zu gewährleisten und die weiteren Schritte zu erleichtern.
- Geben Sie 6 ml der Dispase-/Kollagenaselösung in das zerkleinerte Gewebe. Dann bei 37 °C für ca. 30 min bis 1 h inkubieren.
- Unterbrechen Sie das Gewebe, indem Sie 15–20 Mal mit einer serologischen 5-ml-Pipette pipettieren.
- Bei 37°C weitere 30 min bis 1 h inkubieren.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.3 und 1.4 noch zwei- bis dreimal oder bis das Gewebe einer Aufschlämmung ähnelt und leicht durch die Pipettenöffnung gelangen kann (Abbildung 1D).
Anmerkung: Die Ausgangsgröße der Gewebeprobe und die Feinheit des Gewebezerkleinerns bestimmen, wie oft die Schritte 1.3 und 1.4 wiederholt werden müssen. In der Regel erhalten wir Gewebe mit einer Größe von ca. 1 cm x 1 cm. Darüber hinaus kann man die Dissoziation des Gewebes mit einem inversen Standard-Gewebekulturmikroskop überwachen, um den Fortschritt der Dissoziation der Zellen vom Gewebe zu verfolgen. Kleine Zellcluster sind ideal für das erste Auswachsen von Speichelzellen als Speichelkugeln.
>2. Beschichtung von Vertiefungen mit Basalmembranmatrix
HINWEIS: Die Basalmembranmatrix (BMM) sollte am Tag vor der Verwendung über Nacht bei 4°C aufgetaut werden. Nach dem Auftauen sollte BMM ständig auf Eis oder bei 4 °C gehalten werden, da es sich bei wärmeren Temperaturen schnell verfestigt (d. h. ein Gel bildet). Darüber hinaus ist Vorsicht geboten, wenn die Proben vor dem Plattieren auf BMM auf Eis gekühlt wurden, da kalte Proben das BMM "schmelzen" und die Zellen der Kunststoffschale aussetzen.
- Pipettieren Sie BMM (siehe Materialtabelle) langsam in jede Vertiefung, die beschichtet werden soll. Verteilen Sie das BMM gleichmäßig und langsam über die Vertiefung.
HINWEIS: Im Allgemeinen verwenden wir 500 μl pro Vertiefung einer 6-Well-Platte, aber dieses Volumen kann für die Verwendung auf anderen Plattenvarianten, wie z. B. 12-Well- oder 24-Well-Platten, oder wie gewünscht für dickere oder dünnere Hydrogele angepasst werden.
- Inkubieren Sie die beschichteten Platten vor der Verwendung mindestens 15 Minuten lang bei 37 °C, damit das BMM Zeit zum Erstarren hat.
>3. Filterung von unverdautem Gewebe, Erythrozytenlyse und Zellbeschichtung
- Übertragen Sie das Gewebehomogenat von Schritt 1,5 auf ein konisches 15-ml-Röhrchen. Waschen Sie die Platte einmal mit 6 mL der phosphatgepufferten Kochsalzlösung (DPBS) von Dulbecco, um die restlichen Zellen zu übertragen.
- Filtrieren Sie das Homogenat in ein konisches 50-ml-Röhrchen durch ein 70-μm-Nylonnetz-Zellsieb, um unverdautes Gewebe zu entfernen. Zentrifugieren Sie die passierten Zellen für 5 min bei 500 x g.
- Verdünnen Sie 10x Erythrozyten-Lysepuffer in sterilem dH2O zu einer 1x Arbeitslösung.
- Aspirieren Sie den Überstand. Resuspendieren Sie dann das Zellpellet in 10 mL 1x RBC-Lysepuffer. 5 min bei 37°C inkubieren.
- Fügen Sie 20–25 ml DPBS hinzu, um den Erythrozyten-Lysepuffer zu neutralisieren und die Lyse von Speichelzellen zu minimieren. 5 min bei 500 x g.
zentrifugieren
Anmerkung: Nach der Behandlung mit Erythrozyten-Lysepuffer sollte das Zellpellet weiß sein. Die rote Farbe im Pellet zeigt an, dass nicht alle RBC vollständig lysiert wurden. Wiederholen Sie die Schritte 3.4 bis 3.5, falls dies für eine vollständige Lyse aller Erythrozyten erforderlich ist.
- Aspirieren Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das Pellet in 1–2 ml BEGM pro Vertiefung und platzieren Sie dann die resuspendierten Zellen auf BMM-beschichtete Vertiefungen. Inkubieren bei 37°C.
- Nach der Beschichtung auf BMM bilden sich die Zellen über einen Zeitraum von 2 bis 3 Tagen zu kugelförmigen Strukturen oder "Salisphären". Die Zellen können etwa 5–7 Tage lang als Salisphären aufbewahrt werden, bevor das BMM abzubauen beginnt, so dass die Zellen auf den Kunststoff zugreifen und daran haften und als Monoschicht wachsen können.