Antikörper-konjugierte Nanopartikel-basierte Quantifizierung mittels Dunkelfeldmikroskopie: Ein Verfahren zur Erfassung und Quantifizierung spezifischer Exosomen aus Körperflüssigkeiten

Abstract

Quelle: Wan, M. et al. Verwendung von nanoplasmonenverstärkter Streuung und mikroskopischer Bildgebung mit geringer Vergrößerung zur Quantifizierung von Tumor-Exosomen. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video beschreibt die Verwendung von Dunkelfeldmikroskopie mit geringer Vergrößerung zur Quantifizierung spezifischer Exosomen in biofluidischen Proben mit kleinem Volumen. Die so identifizierten Exosomen können als potenzielle Biomarker für Krebs dienen.

Protocol

>1. Vorbereitung von Nanopartikelsonden

HINWEIS: Dieser Assay verwendet funktionalisierte Gold-Nanostäbchen (AuNRs; 25 nm Durchmesser x 71 nm Länge), die kovalent mit Neutravidin-Polymeren (AV) konjugiert sind und einen Oberflächenplasmonenresonanzpeak haben, der bei DFM-Beleuchtung ein rotes (641 nm Peak) Streusignal erzeugt.

1. 40 μl AuNR-AV (2,56 x 10¹¹ Partikel) werden dreimal mit 200 μl PBS (pH 7,0) durch Zentrifugation und Aspiration (8.500 x g bei 4 °C für 10 Minuten) gewaschen, gefolgt von einem abschließenden Zentrifugations- und Aspirationsschritt, wonach das AuNR-AV-Pe....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eppendorf Repeater Stream	Fisher Scientific	Tel.: 05-401-040
Eppendorf Research plus	Eppendorf	3120000011	0,1 – 2,5 μL, dunkelgrau
Funktionalisierte Gold-Nanostäbchen	Nanopartz	Nr. C12-25-650-TN-DIH-50-1	In-vitro-Neutravidin-Polymer Funktionalisierung
HulaMixer Probenmischer	Thermo Fisher Scientific	15920D
Incu-Shaker 10L	Benchmark Wissenschaftlich	Nr. H1010
Inverses Forschungsmikroskop	Nikon	Ti-DH	Mit Dunkelfeldkondensator, DS-Ri2 Kamera und Ti-SH-U universal Halter und motorisierter Tisch
NIS-Elemente	Nikon		Software für die Bildgebung von Mikroskopen
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1X)	GE Healthcare Life Sciences	SH30256.02	HyClone
Protein A/G behandeltes Glas Substrat-Objektträger	Arrayit Corp.	AGMSM192BC	Hochwertiges Microarray-Substrat
Q500 Ultraschallgerät	Qsonica, LLC	Frage 500-110	Mit Standard-Sonde (#4220)
Superblock-Blockierungspuffer	Thermo Scientific
TWEEN 20	Sigma Lebenswissenschaften	Artikel-Nr.: 9005-64-5