>1. Vorbereitung von Nanopartikelsonden
HINWEIS: Dieser Assay verwendet funktionalisierte Gold-Nanostäbchen (AuNRs; 25 nm Durchmesser x 71 nm Länge), die kovalent mit Neutravidin-Polymeren (AV) konjugiert sind und einen Oberflächenplasmonenresonanzpeak haben, der bei DFM-Beleuchtung ein rotes (641 nm Peak) Streusignal erzeugt.
- 40 μl AuNR-AV (2,56 x 1011 Partikel) werden dreimal mit 200 μl PBS (pH 7,0) durch Zentrifugation und Aspiration (8.500 x g bei 4 °C für 10 Minuten) gewaschen, gefolgt von einem abschließenden Zentrifugations- und Aspirationsschritt, wonach das AuNR-AV-Pellet in 40 μl PBS suspendiert wird.
- Mischen Sie diese AuNR-AV-Suspension mit 10 μl biotinyliertem Antikörper (0,5 mg/ml), der spezifisch für ein Antigen auf der Oberfläche des interessierenden Exosom-Subtyps ist, und 150 μl PBS und mischen Sie dann 2 Stunden lang bei 4 °C mit einem Mischer, damit die Neutravidin-Biotin-Bindung abgeschlossen ist.
- Die resultierenden antikörperkonjugierten AuNRs (AuNR-IgG) werden dreimal durch Zentrifugation und Aspiration gewaschen (6.500 x g bei 4 °C für 10 Minuten) und anschließend in 200 μl PBS suspendiert und bis zur Verwendung bei 4 ΰC gelagert.
Anmerkung: Sterile Technik und kurze Lagerzeiten müssen verwendet werden, um eine Kontamination und einen Abbau des AuNR-IgG zu vermeiden. Es ist am besten, antikörperkonjugierte AuNRs innerhalb von 24 Stunden nach ihrer Konjugation zu verwenden.
>2. Vorbereitung von EV-Capture-Dias
- Verdünnen Sie ausgewählte Exosomen-Capture-Antikörper auf 0,025 mg/ml in PBS und geben Sie 1 μl/Well dieser Verdünnung auf einen Multi-Well-Protein-A/G-Objektträger und inkubieren Sie diesen Objektträger dann 1 h lang bei 37 °C in einer befeuchteten Kammer, um die Bindung von Capture-Antikörpern an das auf dem Objektträger immobilisierte Protein A/G zu ermöglichen.
- Aspirieren Sie die Vertiefungen, um ungebundene Antikörper zu entfernen, und waschen Sie sie dreimal durch Zugabe und Aspiration von 1 μl/Vertiefung PBS. Befüllen Sie dann jede Vertiefung mit 1 μl Blockierungspuffer (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie den Objektträger 2 Stunden lang bei 37 °C in einer befeuchteten Kammer, um alle verbleibenden Proteinbindungsstellen zu blockieren.
- Aspirieren Sie die Wells, um den blockierenden Puffer zu entfernen, waschen Sie die Wells dreimal durch Zugabe und Aspiration von 1 μl/Well PBS und verwenden Sie die blockierten Objektträger sofort für die Exosomenerfassung und -analyse.
>3. Vorbereitung von Standardkurven
- Um die absolute oder relative Häufigkeit eines bestimmten Exosom-Subtyps genau zu quantifizieren, muss der Benutzer eine Standardkurve mit einer reinen Exosomenpopulation erzeugen, die den interessierenden Exosomenoberflächen-Biomarker einheitlich exprimiert. In dieser Studie wird die Häufigkeit von Exosomen analysiert, die ein Metastasen-assoziiertes Membranprotein, den Ephrin A2-Rezeptor, exprimieren, das einen Zusammenhang mit dem Stadium und der Prognose des Bauchspeicheldrüsenkrebses aufweist.
Anmerkung: Es ist bekannt, dass die humane Pankreaskarzinom-Zelllinie PANC-1 und ihre Exosomen dieses Protein exprimieren, und isolierte Exosomen aus dieser Zelllinie wurden verwendet, um eine Standardkurve zur Quantifizierung der Anzahl der Exosomen zu erzeugen, die dieses Protein in komplexen Exosomenproben exprimieren.
- Zellen werden 48 Stunden lang bei 37 °C in serumfreien Kulturmedien kultiviert, um eine Exosomenakkumulation im Medium zu ermöglichen, und dann Zellkulturüberstände durch Zentrifugation von Suspensionskulturen oder direkte Aspiration von Kulturmedien aus adhärenten Zellkulturen isoliert.
- Das gesammelte Medium wird 30 Minuten lang bei 2000 x g zentrifugiert, um Schmutz zu entfernen und den Überstand zurückzugewinnen.
- Der geklärte Kulturüberstand wird durch eine 0,45 μm Filtereinheit mit geringer Proteinbindung und geeigneter Kapazität (z. B. eine 250 mL Polyethersulfon-Vakuumfiltrationseinheit) filtriert.
- Das resultierende Filtrat wird durch Zentrifugation bei 3200 x g unter Verwendung eines Grenzfiltersystems mit einem Nennmolekulargewicht von 100.000 auf ein Endvolumen von 250 μl konzentriert. Sammeln Sie das zurückgehaltene Volumen aus diesem Filter, waschen Sie den Filter mit 200 μl PBS und kombinieren Sie dieses Waschvolumen mit dem gesammelten Exosomenprobenvolumen.
- Zentrifugieren Sie diese Probe 45 Minuten lang bei 21.000 x g und gewinnen Sie den Überstand vorsichtig zurück, wobei darauf zu achten ist, dass sich kein gefälltes Material ansammelt.
- Zentrifugieren Sie den zurückgewonnenen Überstand 3 Stunden lang bei 100.000 x g, um die Exosomen auszufällen. Saugen Sie den Überstand ab und sammeln Sie das Exosomenpellet in 100 μl PBS.
- Lagern Sie die resultierenden Exosomensuspensionen bei 4 °C, wenn sie innerhalb von 24 Stunden verwendet werden, oder bei -80 °C für die Langzeitlagerung.
HINWEIS: Exosomenproben dürfen sich in den Frost-Tau-Zyklen nicht wiederholen .
- Quantifizierung eines Aliquots der Exosomensuspension nach dem Mischen durch direkte Messung der Exosomenzahl (z. B. durch Nanopartikel-Tracking-Analyse oder abstimmbare resistive Impulsmessung oder durch Messung der Proteinkonzentration von Exosomenlysaten durch Mikrobicinchoninsäure-Assay oder eine gleichwertige Methode als Mittel zur Annäherung an die Exosomenmenge).
- Generieren Sie einen Satz serieller Verdünnungen der Exosomensuspension, um einen Vergleich des Nanopartikelsignals mit der eingegebenen Exosomenzahl oder dem Proteingehalt zu ermöglichen.
- Übertragen Sie 1 μl jedes Exosomenstandards in jedes seiner Replikat-Wells auf der Assay-Platte.
HINWEIS: Standardkurven können verwendet werden, um die Steigung der Korrelationslinie zwischen dem Nanopartikelsignal und der Exosomenkonzentration zu berechnen, um (1) die Assay-Leistung zu bewerten und (2) die relative Konzentration von Ziel-Exosomen in experimentellen Proben zu bestimmen.
>4. Verarbeitung von menschlichen Plasma- oder Serumproben
- Sammeln Sie Plasma- oder Serumproben mit Standardmethoden und lagern Sie sie bei -80 °C, bis sie für die Exosomenanalyse benötigt werden. Tauen Sie die Proben schnell in einem Wasserbad bei Raumtemperatur auf. Mischen Sie die aufgetauten Proben wiederholt durch Inversion, um eine homogene Suspension zu fördern.
HINWEIS: Die Ergebnisse von Serum- und Plasmaproben sind möglicherweise nicht gleichwertig, da es während der Gerinnungsreaktion zu einer signifikanten Freisetzung von Exosomen kommt.
- Plasma- oder Serumproben werden 15 Minuten lang bei 500 x g zentrifugiert, um Proteinaggregate und andere Ablagerungen auszufällen. Übertragen Sie ein Aliquot der Plasma- oder Serumprobe in ein frisches Röhrchen und fügen Sie PBS hinzu, um eine 1:1-Verdünnung zu erzeugen. Mischen Sie die verdünnte Probe durch sanftes Vortexen oder Inversion. Übertragen Sie 1 μl jeder Plasma- oder Serumsuspension in jede der replizierten Vertiefungen auf der Assay-Platte.
>5. Einfangen und Nachweisen von Exosomen
- Laden Sie die Vertiefungen eines blockierten EV-Capture-Objektträgers mit 1 μl/Vertiefung Exosomenprobe unter Verwendung von 8 Replikaten pro Probe und inkubieren Sie den Objektträger über Nacht bei 4 °C in einer befeuchteten Kammer. Aspirieren Sie alle Probenvertiefungen und fügen Sie dann 1 μl/Vertiefung PBS hinzu, um die Vertiefungen zu waschen und ungebundene Exosomen und andere Verunreinigungen aus der geladenen Exosomenprobe zu entfernen.
- Beladen Sie die Probenvertiefungen mit 1 μL/Vertiefung einer zuvor hergestellten AuNR-IgG-Suspension (siehe Abschnitt 1 oben) und inkubieren Sie den Objektträger für 2 h bei 37 °C in einer befeuchteten Kammer. Aspirieren Sie die Nanopartikellösung und waschen Sie den Objektträger 10 Minuten lang mit einem Mischer in PBS, ergänzt mit 0,01 % Tween-20 (PBST), dann aspirieren und waschen Sie alle Probenvertiefungen 10 Minuten lang mit einem rotierenden Mischer und trocknen Sie sie an der Luft für nachfolgende LMDFM-Bilder.
HINWEIS: Die Variationskoeffizienten (CVs) zwischen den Assays werden anhand von acht Replikaten derselben Probe bewertet. Stichproben, die Lebensläufe von >20 % aufweisen, gelten als nicht aussagekräftig und sollten wiederholt werden, wenn genügend Stichproben vorhanden sind.
