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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereitung von CTCs
- Berechnen Sie die Anzahl der für die Injektion benötigten CTCs und bereiten Sie eine einzellige Suspension bei 1,0 × 104 Zellen/μl in steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vor. Legen Sie die Zellsuspension während des gesamten Eingriffs auf Eis oder bei 4 °C.
Anmerkung: Wenn Sie Zelllinien verwenden, die eine Trypsinisierung erfordern, achten Sie darauf, die Zellen zweimal mit sterilem PBS zu waschen, um Trypsin zu entfernen. Führen Sie die Zellzählung mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler durch. Wenn eine große Kohorte (>50 Mäuse) verwendet wird, zählen Sie die Zellen neu und validieren Sie die Lebensfähigkeit der Zellen zwischen den Injektionen, um sicherzustellen, dass eine konsistente Anzahl von Zellen pro Maus verabreicht wird.
>2. Präoperatives Verfahren
- Injizieren Sie der Maus subkutan 5 mg/kg Buprenorphin mit verzögerter Freisetzung (Bup-SR).
Anmerkung: Injizieren Sie nicht den Bereich des vorgeschlagenen Schnitts; Wählen Sie eine Injektionsstelle, die weit vom Schulterblatt entfernt ist.
- Betäuben Sie die Maus mit 2–3% Isofluran, bis sie keine Anzeichen des Aufrichtreflexes mehr zeigt. Überprüfen Sie außerdem den Schwanz- und/oder Pfotenkneifreflex, um den Narkosezustand zu bestätigen.
- Bereiten Sie die Maus für die Operation an einem Ort vor, der weit vom Operationsbereich entfernt ist. Schneiden Sie die Operationsstelle (d. h. die dorsale Oberfläche des Schädels) mit genügend Randbereich ab, um zu verhindern, dass das Fell die Inzisionsstelle kontaminiert. Sättigen Sie dann die Stelle mit keimtötendem Hautantiseptikum, arbeiten Sie von der Mitte der Stelle zur Peripherie und lassen Sie sie dann trocknen. Tragen Sie entweder ein steriles Abdecktuch oder ein steriles Kunststofftuch mit selbstklebendem Rücken auf, um die Operationsstelle vor Kontamination zu schützen.
Anmerkung: Die Instrumente sind im Vorfeld autoklaviert und die Spitzen zwischen den Tieren mit einem Glasperlensterilisator erneut zu sterilisieren.
- Rasieren Sie das Fell der gesamten Bauchfläche des Kopfes und bereiten Sie die Haut mit der sterilen Technik vor.
- Positionieren Sie die Nase mit einem modifizierten L-förmigen Nasenkegel des stereotaktischen Geräts, um sicherzustellen, dass die Nasenlöcher klar und offen bleiben. Ziehen Sie die Haut mit Klebeband über die ventralen Oberflächen beider Ohrmuscheln vorsichtig nach vorne, um sie am Nasenkegel zu befestigen, und biegen Sie den Hals in einem Winkel von etwa 90°, sobald er gesichert ist. Verabreichen Sie 1,5 % Isofluran, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten.
Anmerkung: Die richtige Positionierung führt dazu, dass der Inzisionsbereich so dargestellt wird, dass der kaudale Kamm des Hinterhauptbeins leicht identifiziert werden kann.
- Positionieren Sie den Körper so, dass die Wirbelsäule auf gleicher Höhe mit der Cisterna magna bleibt, und legen Sie bei leichtem Zug auf den Schwanz Klebeband an der Schwanzbasis, um ihn zu sichern.
>3. Chirurgische Cisterna Magna Injektion
- Führen Sie den Hals in voller Streckung und beginnend direkt zwischen den Ohrmuscheln mit den chirurgischen Scherenspitzen mit leichtem Druck über das Hinterhauptbein nach unten.
Anmerkung: In dieser Mittellinienstellung macht sich eine kleine Vertiefung bemerkbar, wenn die Scherenspitzen in den konkaven Bereich über der Cisterna magna eintauchen.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt von 3–5 mm in der Mittellinie direkt über der palpierten Konkavität. 5 μl Zellsuspension in einer Dosis von 1,0 × 104 Zellen/μl (insgesamt 5,0 × 104 Zellen) in eine 30 G Hamilton Spritze geben.
- Verwenden Sie eine stumpfe Pinzette mit 1–2 mm Spitzen, um die Cisterna magna sanft nach unten zu drücken. Führen Sie die Spitzen in geschlossener Position ein und öffnen Sie sie, während Sie Druck nach unten auf die Dura ausüben.
- Wiederholen Sie die im vorherigen Schritt beschriebene stumpfe Dissektion, bis die Duralmembran leicht identifiziert werden kann und die zugehörigen Blutgefäße im exponierten Bereich sichtbar sind.
Anmerkung: Das resultierende Injektionsfenster stellt sicher, dass die Blutgefäße während des Einführens der Nadel nicht beschädigt werden.
- Während Sie die Pinzette offen halten, um die umgebende Muskulatur zurückzuziehen, führen Sie eine 30 G starke Nadel ohne Kern unter die Dura ein, um die Fase sichtbar zu machen. Stellen Sie sicher, dass die Nadel nur knapp hinter der Fase selbst eingeführt wird. Setzen Sie langsam einen Spritzenkolben ein und geben Sie die Zellen direkt unter der Dura ab.
- Platzieren Sie die Fase richtig, um die Injektion unter der Dura zu beobachten. Führen Sie die Technik sorgfältig durch und verwenden Sie die 30-G-Nadel ohne Kern, um eine Beschädigung der Membran zu vermeiden und ein minimales Auslaufen zu gewährleisten. Wenn eine Leckage festgestellt wird, üben Sie sanften Druck mit einem Applikator mit Wattespitze aus.
- Verschließen Sie die Haut, indem Sie einen Wundclip oder einen Mikrotropfen Hautkleber auftragen. Sobald die Injektion erfolgreich durchgeführt wurde, lassen Sie die Mäuse sich auf einer warmen Decke von der Narkose erholen und beobachten Sie sie kontinuierlich, bis sie die sternale Position beibehalten und gezielte Bewegungen zeigen können.
- Überwachen Sie die Mäuse in der ersten Woche täglich nach der Operation. Wenn eine Maus Schmerzen oder Ängste zu haben scheint, behandeln Sie sie mit 10 mg/kg subkutaner Injektion von Carprofen einmal alle 12 bis 24 Stunden für bis zu 5 Tage, basierend auf tierärztlicher Beratung und Anweisung. Lassen Sie die Mäuse sich erholen und überwachen Sie sie mindestens 48 bis 72 Stunden, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
Anmerkung: Bup-SR, präventiv verabreicht, hält bis zu 72 Stunden an, so dass zusätzliche Analgetika normalerweise nicht erforderlich sind. Die Tiere erhalten jedoch bei Bedarf zusätzliche Schmerzmittel (wenn sie lethargisch sind, nicht fressen, zerzaust). Wenn an einer Operationsstelle Anzeichen einer postoperativen Infektion auftreten (z. B. Rötung, Schwellung, Druckempfindlichkeit, Allodynie, Hyperalgesie, Hyperpathie oder Eiterung) oder wenn die Maus den betroffenen Bereich bewacht, schläfern Sie die Maus ein. Wenn Krebszellen erfolgreich in den Liquor injiziert werden, entwickeln sich innerhalb von 1 bis 2 Wochen LMD und Tumorprogression im ZNS (abhängig von der Art der verwendeten CTCs oder Zelllinie) (Abbildung 1).
