Intrazerebroventrikuläre Injektion in der Maus: Eine von Ommaya vermittelte Methode zur direkten Verabreichung von Medikamenten an die Hirnventrikel des Mausgehirns

Zusammenfassung

Quelle: Law, V. et al. Ein murines Ommaya-Xenotransplantat-Modell zur Untersuchung der direkten zielgerichteten Therapie der leptomeningealen Erkrankung. J. Vis. exp. (2021)

Dieses Video zeigt die intrazerebroventrikuläre Injektion von Ommaya in einem Mausmodell. Die Methode ermöglicht eine lokalisierte Verabreichung potenzieller Wirkstoffkandidaten und umgeht die Blut-Hirn-Schranke.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Assemblierung und Implantation von Maus-Ommaya

1. Vorbereitung der Station
   1. Desinfizieren Sie die Stationsoberfläche. Legen Sie eine blaue Abdeckung über die Oberfläche und halten Sie alle in Abbildung 1 gezeigten sterilisierten Werkzeuge und Verbrauchsmaterialien bereit.
2. Präoperativer Eingriff
   1. Wenden Sie eine Analgesie (Bup-SR) an und halten Sie eine sterile chirurgische Umgebung aufrecht.
3. Chirurgische Implantation von muriner Ommaya
   1. Montieren Sie die Maus-Ommaya-Injektionsvorrichtung mit einer 25G-Miniatur-Injektionsöffnung (0,51 mm Außendurchmesser) und einer 1-mm-Abstandsscheibe. Verwenden Sie einen sterilen Cyanacrylat-Klebstoff, um sicherzustellen, dass ca. 2,5 mm der Metallkanüle in die rechte Gehirnhälfte eindringen (Abbildung 2A–C).
      Anmerkung: In diesem Labor wurde ein MRT-kompatibler Maus-Ommaya-Prototyp entwickelt, bei dem beide Teile (Miniatur-Injektionsöffnung und Abstandshalter) bereits zusammen als eine Einheit 3D-gedruckt wurden (Abbildung 2D). Die Einzelversion wurde per MRT getestet und kann Zeit sparen, da der Montageschritt entfällt.
   2. Betäuben Sie die Maus mit 2–3% Isofluran, bis keine Anzeichen des Aufrichtreflexes mehr zu sehen sind. Überprüfen Sie außerdem den Schwanz- und/oder Pfotenkneifreflex, um den Anästhesiezustand zu bestätigen.
   3. Rasieren Sie die gesamte Bauchfläche des Fellkopfes und bereiten Sie die Haut gemäß der sterilen Technik vor. Platzieren Sie die Maus mit einem Nasenkegel in das stereotaktische Gerät, um die Verabreichung von Isofluran während des Eingriffs fortzusetzen. Senken Sie das Isofluran auf 1,5%. Ziehen Sie die Ohrbügel vorsichtig fest, um den Kopf zu sichern, und tragen Sie Augenschmiermittel auf, um die Augen der Maus zu bedecken.
   4. Machen Sie einen kleinen Hautschnitt (3 mm), gefolgt von einer stumpfen Dissektion des darunter liegenden Unterhautgewebes, um den Schädel freizulegen. Trocknen Sie den Schädel mit Wasserstoffperoxid-getränkten Applikatorstiften mit Wattespitze.
   5. Bohren Sie ein Bohrloch in den Schädel 0,5 mm posterior und 1,1 mm lateral des Bregmas - den anatomischen Punkt am Schädel, an dem die koronale Naht senkrecht von der sagittalen Naht geschnitten wird (Abbildung 2A) sowie ein 0,9 mm großes Bohrloch, um die Dura mater freizulegen. Schieben Sie den Mikrobohrer zur Seite und ritzen Sie den Knochen unmittelbar um das Bohrloch herum vorsichtig ein, bevor Sie eine Injektionsöffnung (Tiefe von ca. 2,5 mm) einsetzen, die mit einem sterilen Cyanacrylat-Klebstoff am Schädel befestigt ist. Legen Sie die Naht um die Injektionsstelle mit 4-0 Nylonnähten ohne Saugfähigkeit in einem unterbrochenen Stichmuster oder einer Handtaschennaht fest.
   6. Halten Sie Mäuse nach der Operation in einzelnen Käfigen für die Genesung nach der Operation.
      Anmerkung: Es ist möglich, dass sich die Maus-Ommaya löst, wenn mehrere operierte Mäuse im selben Käfig untergebracht sind, möglicherweise aufgrund ständiger Manipulationsinteraktionen. Es wird empfohlen, mit Maus Ommaya implantierte Mäuse im Verlauf der Wirksamkeitsstudie einzeln (oder nicht mehr als 2 Mäuse pro Käfig) unterzubringen.

>2. Behandlung von Ommaya bei Mäusen

1. Dosierung von Mäusen mit der Maus Ommaya
   1. Betäuben Sie die Maus mit 2–3% Isofluran, bis keine Anzeichen eines Aufrichtungsreflexes mehr zu sehen sind. Überprüfen Sie außerdem den Schwanz- und/oder Pfotenkneifreflex, um die Aufrechterhaltung der Anästhesie zu bestätigen.
   2. Greifen Sie mit einem Port-Injektionsadapter und einer Hamilton-Spritze auf die Murine Ommaya zu. Halten Sie mit einer Pinzette die Oberseite des Miniatur-Injektionsanschlusses fest und führen Sie den Injektoradapter vorsichtig vollständig in das Septum des Anschlusses ein.
      Anmerkung: Der Port-Injektor durchsticht das Septum des Ports auf eine Weise, die den Totraum auf ein Minimum reduziert und eine kontrollierte Injektion über eine motorisierte Spritzenpumpe ermöglicht (Abbildung 3A). Gezielte/neuartige Behandlungen werden unter Narkose mit einer Flussrate von 1 μL/min injiziert. Die Behandlung ist in festgelegten Abständen (täglich/wöchentlich) für eine festgelegte Dauer (Wochen/Monate) nach Ermessen des Forschers durchzuführen.
      Ein Volumen zwischen 3 und 7 μl ist optimal, da ein Volumen <3 μl unzuverlässig ist und ein Volumen >7 μl zu viel Druck verursachen kann. Die Größe der Hamilton-Spritze kann zwischen 10 und 100 μl liegen, abhängig von der Anzahl der Mäuse in jedem Behandlungsarm. Das Vorladen des entsprechenden Volumens in die Hamilton-Spritze verhindert einen wiederholten Austausch der Spritze und minimiert so Fehler. Es ist am besten, 1 Hamilton-Spritze pro Behandlungsarm zu widmen.
   3. Sobald die Injektion erfolgt ist, lösen Sie die Maus Ommaya mit einer Pinzette vom Port-Injektionsadapter und bringen Sie die Maus wieder in den Käfig zurück, um sich von der Narkose zu erholen.

Ergebnisse

Abbildung 1: Ein Beispiel für einen Arbeitsplatzaufbau für die Durchführung der murinen Ommaya-Implantation bei Mäusen. (1) Gasanästhesiegerät/Verdampfer. (2) Steriles blaues Papiertuch, das einen stereotaktischen Ständer abdeckt. (3) Stereotaktisches Gerät (Ständer/Tisch, Ohrstangen, Nasenkonus). (4) Mikrobohrer. (5) Lupe mit Licht. (6) Sterile Applikatorstifte mit Wattespitze und sterilem Spülbehälter mit Kochsalzlösung. (7) Wasserstoffperoxid. (8)...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1 mm Distanzscheibe	Alzet, Durect Corporation	#0008670	Nur Spacer-Scheibe
4-0 Ethilon-Nylon-Naht	Jeder Anbieter
Automatische Spritzenpumpen	Harvard Spritzenpumpen (oder ein anderer Anbieter)	Nr. #70-4505	Pumpe 11 Elite
Bead-Sterilisator	Braintree Scientific Inc. (oder ein anderer Anbieter)	#GER 5287-120V	Keimer 500
Buprenorphin mit verzögerter Freisetzung (Bup-SR)	Zoopharm		DEA-gesteuert
Cyanacrylat steriler Klebstoff	Jeder Anbieter
Anestehsia-System zur Gasinhalation	VeteEquip	#901812	COMPAC5
Hamilton Mikroliter-Spritzen	Hamilton		10, 25, 50 und 100 μL; 30G für die Injektion von Cisterna magna
Wasserstoffperoxid	Jeder Anbieter
IVIS 200 Bildgebungssystem	Caliper Biowissenschaften
Lupe mit Licht	Jeder Anbieter
Mikrobohrer	Stoelting (oder ein beliebiger Anbieter)	#51555M
MRT-Bildgebung	Bruker	BioSpec-Serie	wahlfrei
Maus Ommaya (MRT-kompatibel) Prototyp	Instech Laboratories, Inc.	#VAB620-25MRT-3.3
PinPort-Injektor	Instech Laboratories, Inc.	#PNP3M-50
PinPort	Instech Laboratories, Inc.	#1-PNP3F28-50
Chirurgische Instrumente für Nagetiere (Schere, Pinzette)	Roboz Chirurgisches Instrument (oder ein anderer Anbieter)
Stereotaktisches Gerät	Stoelting (oder ein beliebiger Anbieter)	#51730M
Steriles blaues Papier/Tuchabdeckung	Jeder Anbieter
Sterile Wattestäbchen	Jeder Anbieter