Luciferase-markiertes Gliom-Stammzellmodell: Eine Lentivirus-vermittelte Methode zur Vorbereitung von Luciferase-markierten Gliom-Stammzellen für therapeutische In-vitro-Studien

Zusammenfassung

Quelle: Hu, Z. et al. Ein schneller Screening-Workflow zur Identifizierung potenzieller Kombinationstherapien für GBM unter Verwendung von patienteneigenen Gliom-Stammzellen. J. Vis. Exp. (2021)

Dieses Video zeigt die Etablierung von Luciferase-markierten Gliom-Stammzellen durch Lentivirus-vermittelte Genabgabe. Luciferase fungiert als Reportergen und erleichtert schnelle Experimente zum Wirkstoffscreening.

Protokoll

>1. Vorbereitung von mit Luziferase markierten GSCs

1. Beginnen Sie mit der GSC-Kultur und zentrifugieren Sie sie bei 70 x g für 3 Minuten bei Raumtemperatur.
2. Entfernen Sie den Überstand und verdauen Sie die Zellen 4 Minuten lang bei 37 °C mit Accutase. Verwenden Sie eine 200-μl-Spitze und pipettieren Sie wiederholt, um das Zellpellet zu dissoziieren und wieder zu suspendieren.
3. Verdünnen Sie die Zellen auf 2 x 10⁵ Zellen pro Well in einer 12-Well-Kulturplatte und kultivieren Sie die Zellen über Nacht.
4. Geben Sie 30 μl Luciferase-EGFP-Virusüberstand (Titer >10⁸ UE/ml) in jede Vertiefung in der Platte und zentrifugieren Sie die Zellen dann bei 1.000 x g für 2 h bei 25 °C. Kulturieren Sie die Zellen über Nacht.
5. Frischen Sie das Medium am nächsten Tag auf und kultivieren Sie die Zellen für weitere 48 Stunden.
6. Beobachten Sie die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop, um das Aussehen der GFP-positiven Zellen zu bestätigen.
7. Verwenden Sie einen Durchflusszellensortierer, um die GSCs mit hoher GFP-Fluoreszenz zu sortieren und auszuwählen, um die Zellen weiter zu kultivieren.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
B-27	Gibco	Artikel-Nr.: 17504-044	50-mal
EGF	Gibco	PHG0313	20 ng/ml
FGF	Gibco	PHG0263	20 ng/ml
Gluta Max	Gibco	35050061	100-mal
Neurobasal	Gibco	21103049	1-mal
Penicillin-Streptomycin	HyClone	SV30010	P: 10.000 Einheiten/ml S: 10.000 μg/ml
Natriumpyruvat	Gibco	2088876	ca. 100 mM